木糖酸氧化途徑在枯草芽孢桿菌的構建及轉化乙醇酸的研究

凌翓 紀明華 段海燕 史吉平，3 孫俊松，3

（1. 中國科學院上海高等研究院，上海 201210；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 上?？萍即髮W，上海 201210）

乙醇酸是一種水溶性α-羥基酸（AHA），通常被添加到乳液聚合物、溶劑、油墨或涂料中改善制劑的流動性并增加其光澤度。因此常用于表面處理，是家用清潔液中常用的活性成分，同時在紡織工業中作為染色劑和鞣劑被廣泛使用［1]。乙醇酸也是護膚品工業中最廣泛使用的α-羥基酸之一，其分子很小，可以輕易地穿透皮膚、刺激膠原蛋白的再生，且相比于其他AHA，乙醇酸對于加速衰老皮膚脫落的功效更加顯著［2-3]。此外，乙醇酸還可在食品加工中作為調味劑和防腐劑［4]。

乙醇酸的工業制備主要是利用甲醛羰基化的合成路徑，使用合成氣進行催化，這種方式成本較低［5]。也可以通過氯乙酸與氫氧化鈉反應后的再次酸化去氯制備乙醇酸［6]。其他方式包括草酸加氫等也可制備［7]，但價格較高。此外，包括大腸桿菌等在內的多種微生物存在著氧化木糖獲得2-酮-3-脫氧-D-木糖酸，再經過醛縮酶催化后生成乙醇酸的Dahms Pathway（圖 1）［8]。

枯草芽孢桿菌是一種獲得了GRAS認證地位的、可用于食品工業的安全生產菌株，具有高分泌胞外蛋白、不含脂多糖等諸多優良特性，被大量用于工業蛋白的生產［9]。此外，這類生產菌株營養代謝譜廣，代謝產物較豐富，近年來也被用于多種化學品的生物制造，尤其是用于食品及化妝品市場的有機物的合成［10]。雖然枯草芽孢桿菌可以利用木糖為碳源，卻缺少將木糖氧化為木糖酸，再合成乙醇酸的天然途徑。為了能夠獲得一株可以生產乙醇酸的食品安全菌，本研究將來自大腸桿菌的Dahms Pathway引入枯草芽孢桿菌，發現重組菌株可以結合自身的醛縮酶同工酶，僅在過表達YjhG后就可以將木糖酸高效地轉化為乙醇酸。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株、質粒信息以及PCR所用的模板及引物序列等信息如表1所列，其中枯草芽孢桿菌A164S為實驗室改造的實驗菌株［11]。

表1 菌株，質粒和引物

基因組DNA提取試劑盒、PCR清潔試劑盒、質粒小劑量提取試劑盒等，購自杭州愛思進生物技術有限公司；Taq DNA聚合酶，康為世紀生物科技有限公司；限制性內切酶BamH I，賽默飛世爾科技公司；堿性磷酸酶CIAP，寶日醫生物技術（北京）有限公司；Phanta高保真DNA聚合酶、一步克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司。

S1000TMPCR擴增儀，伯樂生命醫學產品（上海）有限責任公司；Tanon EPS30電泳槽及Gel DocTM XR+全自動凝膠成像儀，伯樂生命醫學產品（上海）有限責任公司；NANODROP 2000c微量分光光度計，賽默飛世爾科技公司；高效液相色譜儀，日本島津制作所株式會社；高速冷凍離心機，艾本德生命科學儀器有限公司；恒溫培養箱及恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基的配制 大腸桿菌及枯草芽孢桿菌的搖瓶培養均使用LB培養基：10 g/L 氯化鈉，10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母浸取物；枯草芽孢桿菌A164S誘導轉化培養基為含1%（W/V）木糖的LB培養基；發酵產乙醇酸的培養基為添加了30 g/L木糖酸的LB培養基。在實驗需要時，添加的氨芐青霉素（Amp）濃度為100 μg/mL，芽孢桿菌培養時所用的氯霉素（Cm）濃度為 7.5 μg/mL。

1.2.2 質粒構建 以大腸桿菌E. coliW3110為模板，以引物對YjhGeco-F和YjhGeco-R進行高保真PCR得到目標yjhG基因產物，以引物對YjhHeco-F和YjhGeco-R進行高保真PCR得到目標yjhH-yjhG雙基因產物（引物序列見表1），將得到的PCR產物進行清潔并測定濃度。用BamH I快切酶將質粒pMK4-PxylA-comK 線性化并切除comKDNA 片段［11]，在37℃中反應3 h后加入1 μL堿性磷酸酶，繼續反應1 h后進行清潔并測定濃度。將清潔后的質粒和片段通過一步克隆試劑盒進行連接，之后立即進行轉化，轉化子經colony PCR驗證后，提取質粒DNA，通過DNA測序驗證了質粒構建的正確性。

1.2.3 大腸桿菌感受態的制備及誘導轉化 大腸桿菌E. coliDH5α感受態的制作采用氯化鈣法，置于-80℃冰柜保存。將轉化所需的化學感受態細胞置于冰上解凍，取10 μL重組產物加入到100 μL感受態細胞中，輕彈管壁混勻，冰上放置30 min。放入42℃水浴中熱激90 s，立即置于冰上冷卻1-2 min。加入700 μL無抗LB液體培養基，37℃搖床200 r/min培養1 h。將Amp抗性的LB固體培養基平板在37℃培養箱中預熱。取出轉化細胞，500 r/min離心5 min后棄掉400 μL上清，用剩余培養基重懸菌體后用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。37℃培養箱中倒置培養12-16 h。長出單菌落后，挑取菌落進行PCR驗證并印章，引物為質粒上的特有片段。

1.2.4 枯草芽孢桿菌感受態的制備及誘導轉化 將單克隆菌株B. subtilisA164S轉接到3 mL液體LB試管中，過夜培養8-12 h。吸取62 μL的木糖溶液0.5 g/mL加入到一支新鮮的3 mL液體LB試管中，37℃預熱。加入0.3 mL的過夜培養A164S菌液，在37℃ 200 r/min搖床中培養3 h，即得到枯草芽孢桿菌A164S的轉化感受態。用2.0 mL的無菌EP管進行分裝，每管加入菌液0.5 mL。每管感受態細胞加入1.0 μg質粒，混勻后在37℃ 200 r/min搖床中培養1.5 h。將氯霉素抗性的LB固體培養基平板在37℃培養箱中預熱。取出轉化細胞，500 r/min離心5 min后棄掉300 μL上清，用剩余培養基重懸菌體后用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。37℃培養箱中倒置培養12-16 h。當平板上長出陽性轉化子后，挑取單克隆，通過colony PCR驗證質粒的存在。

1.2.5 搖瓶發酵實驗 將轉入已構建成功質粒的A164S菌株轉接入搖瓶進行發酵。在平板上挑取經過驗證的單克隆，轉接到3 mL帶有氯霉素抗性的LB液體培養基中，過夜培養8-12 h。將LB培養基分裝到250 mL的三角瓶中，每個瓶子裝50 mL。將已滅菌的木糖酸加入LB培養基，使終濃度為20 g/L。將過夜培養的菌液全部轉接到三角瓶，在37℃ 200 r/min搖床中進行培養。當OD600約0.4時加入0.5 g/mL的木糖溶液500 mL。

1.2.6 高效液相色譜檢測 標準樣品測定及發酵液組分測定均采用高效液相色譜法，色譜柱為HPX-87H，流動相為0.005 mol /L的稀硫酸溶液，流速為 0.8 mL/min，柱溫箱溫度為60℃，進樣體積為20 μL，使用視差檢測器和紫外檢測器進行檢測。

精密稱取木糖酸標準品約0.1 g（精確至0.1 mg），用去離子水溶解制成1 mL標準品儲備液，濃度為100 g/L，4℃冰箱內保存。取適量木糖酸標準品儲備液，稀釋成（g/L）：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10系列濃度的標準樣品，按上述色譜條件采集10張色譜圖，以木糖酸標準樣品的峰面積y對標準樣品的質量濃度x（g/L）做標準曲線。

精密稱取乙醇酸標準品約0.1 g（精確至0.1 mg），用去離子水溶解制成1 mL標準品儲備液，濃度為100 g/L，4℃冰箱內保存。取適量乙醇酸標準品儲備液，稀釋成（g/L）：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10系列濃度的標準樣品，按上述色譜條件采集10張色譜圖，以乙醇酸標準樣品的峰面積y對標準樣品的質量濃度x（g/L）做標準曲線。

每隔一定時間將發酵所用三角瓶從搖床中取出，在超凈工作臺中吸取1 mL發酵液到1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心10 min后將上清收集到干凈的1.5 mL EP管。將發酵液稀釋10倍，用1 mL針管吸取約300 μL后，通過0.22 μm親水針式濾器加入襯管中，制成液相樣品，按上述色譜條件進行色譜圖采集。

2 結果

2.1 代謝途徑分析及質粒構建

枯草芽孢桿菌可以利用木糖作為碳源，經磷酸化后由5-磷酸核酮糖進入五糖磷酸途徑（Pentose Phosphate Pathway），但沒有直接氧化木糖產生乙醇酸的代謝途徑，如圖1所示。而大腸桿菌中存在這個代謝途徑，因此，本研究選取來自大腸桿菌Dahms Pathway的兩個酶，在枯草芽孢桿菌中作過表達。

如圖2所示，來自大腸桿菌的yjhH以及yjhG構成一個操縱子，因此可以由一次PCR完成對兩個基因的同時克隆。質粒pMK4-comK經BamH I線性化后，通過一步克隆試劑盒與DNA片段連接，得到質粒pMK4-yjhHG。質粒pMK4-yjhG則用來只表達YjhG，兩個基因的轉錄均由可誘導的木糖啟動子PxylA完成。質粒構建完成后，經化學轉化，轉入高轉化效率的枯草芽孢桿菌A164S，分別得到轉化子A164S-HG和A164S-G。

圖1 枯草芽孢桿菌的木糖及引入的木糖酸代謝途徑示意圖

將重組菌培養后，利用質粒提取試劑盒從重組細胞中提取質粒DNA，再利用BamH I進行酶切，分別得到一條約7 000 bp的質粒條帶以及一條約1 000 bp（yjhG）的條帶和約2 000 bp（yjhH）的DNA條帶，如圖3所示。

2.2 代謝底物及產物的鑒定及標準品定量

如圖1所示，yjhG編碼的蛋白是木糖酸脫水酶，它的催化產物是2-酮-3-脫氧-D-木酮酸，該化學中間體在醛縮酶（YjhH）的作用下，生成乙醇醛及丙酮酸。為了測定導入了Dahms Pathway的重組枯草芽孢桿菌的生物活性，以未轉入質粒的枯草芽孢桿菌A164S作為對照，在發酵預實驗中，發現轉化子A164S-HG和A164S-G的發酵液中檢測到了底物木糖酸的消耗及新產物的產生，通過與乙醇酸及其他可能產物（乙醇醛、乙二醇）標準樣品色譜圖進行比對，確定產物成分為乙醇酸，如圖4所示。

為了檢測新產物的濃度，進行了乙醇酸標準濃度的測定（圖5-A），乙醇酸的濃度和形成的紫外吸收峰面積之間的線性相關系數（R2）為0.998（圖5-B）。

2.3 YjhG以及YjhHG在枯草芽孢桿菌的誘導表達

3個不同的轉化子A164S、A164S-HG或A164S-G，被平行接入加入5 g/L木糖和30 g/L的木糖酸的LB培養基中進行搖瓶發酵，發酵過程中每隔一段時間取樣進行OD600測定和發酵液組分測定。

OD600測定結果如圖6-A所示，A164S-G轉化子的生長情況略優于A164S-HG。通過對色譜圖中相應物質的峰面積進行分析后，比較標準曲線可分別得到這兩種重組菌木糖酸的消耗量和乙醇酸的產生量，如圖6-B所示。重組枯草芽孢桿菌A164S-G的乙醇酸最高可生成約1.5 g/L的乙醇酸，消耗的木糖酸約為5.3 g/L，摩爾轉化率達到42.54%，其乙醇酸的產量反而大大高于同時表達YjhG和YjhH的轉化子A164S-HG。

圖2 質粒構建及轉化示意圖

圖3 質粒構建及酶切驗證電泳圖

圖4 代謝產物鑒定色譜圖

圖5 乙醇酸標樣濃度的確定

3 討論

隨著對微生物代謝途徑的深入了解，利用來自生物質原料的廉價木糖組分進行發酵生產的研究進展飛速［12]。木糖可以用于酒精生產，或直接被轉化為一些重要的化學原料，如木糖醇或木糖酸［13]。而木糖酸不僅是一種重要的水泥工業原料，也是一些微生物進一步代謝利用的底物，但枯草芽孢桿菌并不能代謝木糖酸，讓這種食品工業重要微生物獲得利用木糖酸進行代謝的能力具有重要意義。通過KEGG代謝網絡數據庫對多種微生物的代謝途徑的分析，發現大腸桿菌、陰溝腸桿菌等微生物均具有水解木糖酸的能力。因此，本文構建了基于木糖酸脫水酶（YjhG）及2-酮3-脫氧-D-木糖酸醛縮酶（YjhH）的代謝支路（圖1），該支路也稱為Dahms Pathway［8]。將大腸桿菌YjhH蛋白的氨基酸序列在NCBI數據庫中進行比對，發現枯草芽孢桿菌168存在兩個同源性較高的蛋白。將這些蛋白進行比對分析后，如圖7所示，原來注釋為4-羥基四氫吡啶合酶DapA蛋白與YjhH的同源性為31%；而原來注釋為5-脫氫-4-脫氧葡糖二酸脫水酶的KdgD蛋白與YjhH的同源性為27%。因此，為了確定枯草芽孢桿菌是否具有自身的2-酮3-脫氧-D-木糖酸醛縮酶活性，本研究除了共表達YjhG/YjhH之外，還單獨表達了YjhG。實驗結果表明，與枯草芽孢桿菌168高度同源的菌株A164S在單獨表達YjhG后就可以獲得來自于2-酮-3-脫氧-D-木糖酸裂解后的終產物-乙醇酸，這說明A164S含有YjhH的同工酶。

圖6 重組枯草芽孢桿菌代謝木糖酸的發酵實驗結果

圖7 大腸桿菌YjhH與枯草芽孢桿菌168同源蛋白的比對分析

此外，2-酮-3-脫氧-D-木糖酸裂解的直接產物為乙醛酸及丙酮酸，丙酮酸將被代謝利用，而乙醛酸為高活性化合物，微生物通常會利用菌體內非特異的氧化酶或還原酶將其轉化為乙醇酸或乙二醇。而在本研究中，無論是過表達了YjhG還是YjhH/YjhG的重組菌的發酵液中均檢測不到乙二醇（圖1示意圖中的可能產物）。這可能由于枯草芽孢桿菌為好氧型微生物，乙醇醛還原酶的表達量很低所致［14]。同時，實驗發現表達雙基因YjhHG的重組菌的乙醇酸產率低于單獨表達YjhG的重組菌，這可能是由于來自大腸桿菌的原始的核糖體識別位點（RBS）在枯草芽孢桿菌中效率不高所造成的。如圖1中的基因間序列所示，來自大腸桿菌的原始RBS序列（圖1）缺乏枯草芽孢桿菌RBS的典型特征序列（GGAGG）［15]。后續研究若要提高木糖酸的轉化效率，除了可以進行RBS的優化，還可以對YjhG和YjhH進行分別表達。此外，雙基因表達（YjhHG）的轉化效率低于單獨表達YjhG的效率，且重組菌的木糖酸的利用率相當低（低于20%），說明微生物自身含YjhH的同工酶，同時也表明YjhG可能是木糖酸氧化過程中的限速酶。因此，未來除了要通過分子生物學手段進一步提高YjhG的表達量，還需要開展YjhG的酶學特征及工程改造研究。此外，還有必要引入來自其他微生物，如新月莖桿菌的Weimberg pathway［16-17]，進一步豐富重組枯草芽孢桿菌的代謝途徑，并獲得直接利用木糖氧化生成木糖酸的能力。綜上所述，本研究證實了重組枯草芽孢桿菌生產食品安全級乙醇酸生產的可行性，為進一步開發乙醇酸工業生產菌株奠定了研究基礎。

4 結論

以枯草芽孢桿菌為研究對象，通過質粒過表達來自大腸桿菌的Dahms Pathway。對獲得的轉化子進行發酵研究后表明，在枯草芽孢桿菌中單獨表達YjhG就可以讓宿主細胞獲得利用木糖酸的能力，在搖瓶培養時發酵轉化生成乙醇酸的產量達到約1.5 g/L，轉化率約為42.54%；發酵產物中只發現乙醇酸的生成，沒有乙二醇，表明構建的重組枯草芽孢桿菌在好氧培養時有利于乙醇酸的合成及后續的產物純化。研究發現，木糖酸的利用率還比較低，因此，后續有必要開展Dahms Pathway的過表達優化研究，以提高乙醇酸的產量及轉化率。