不同氮源及氮濃度對耐高鹽真眼點藻生長、脂類積累及脂肪酸組成的影響

趙偉 李濤 吳華蓮 陳浩 劉德海 向文洲 吳后波

（1. 中國科學院南海海洋研究所，中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室，廣州 510301；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 中國科學院南海生態環境工程創新研究院，廣州 510301；4. 廣州市白云聯佳精細化工廠，廣州 510412）

真眼點藻屬（Eustigmatos）藻類可以積累超過干重60%的儲藏性油脂和長鏈二十碳五烯酸（C20∶5，EPA）等多不飽和脂肪酸，受到國內外科學家的廣泛關注。真眼點藻發現之初被劃分在黃藻綱，20世紀70年代，Hibberd和Leedale將其分出并設立獨立的真眼點藻綱（Eustigmatophyceae），目前已發現14個屬、超過30多個種［1-3]。目前發現的真眼點藻屬均為淡水種，尚未見適應高鹽海水的報道。

本課題組于2017年在寧夏固原市羅洼鄉一處荒漠表層基質中分離純化獲得一株真眼點藻類似藻株，經18S RNA序列分析和形態鑒定，發現該藻株與波氏真眼點藻（E.polyphem）具有非常高的相似性，該藻可在的高鹽海水中適應生長，其中15‰為最適鹽度（結果另行發表）。

研究表明，不同真眼點藻在營養需求、生長情況、油脂積累和脂肪酸組成方面存在較大差異，在眾多影響微藻生長和脂類積累的因素中，氮元素的影響最為明顯，利用氮限制方式培養微藻，也常常被用來評價微藻油脂的生產能力［4]。氮源和氮濃度對真眼點藻生理生化的影響，國內已開展大量的研究工作。蘇怡等［5]對8株真眼點藻綱微藻的生長和油脂積累進行了研究，結果表明，不同硝酸鈉濃度對8株微藻的油脂含量的影響極為明顯，8株微藻均在3 mmol/L氮濃度條件下油脂含量達到最高，其中魏氏真眼點藻油脂積累量約為60%干重（Dry weight，DW）。周芷薇等研究表明，斧形魏氏藻和點狀魏氏藻在硝酸鈉濃度為3.6 mmol/L條件下，兩種微藻的油脂含量分別為56.4% DW和64.7% DW［6]。何思思等［7]對一株魏氏真眼點藻的研究表明，該株在低氮（3 mmol/L）條件下總脂含量高達60.81%，明顯高于其在高氮組（17.6 mmol/L）的總脂含量。

本論文以獲得的適應高鹽的真眼點藻SCSIO-45821藻株為實驗材料，通過研究其在不同氮源和氮濃度條件下的生長及油脂積累情況，對該藻株的應用潛力進行初步評估。設置硝酸鈉（NaNO3）、尿素（Urea）、碳酸氫銨（NH4HCO3）三種氮源，每種氮源設置高、中、低三種氮濃度（3.5 mmol/L、5.9 mmol/L、17.6 mmol/L），跟蹤測定藻細胞生長、總脂含量、脂類及脂肪酸組成，并計算總脂產量和EPA產量，研究結果為該真眼點藻SCSIO-45821的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 本實驗研究的藻株采自寧夏固原市羅洼鄉，利用多次平板涂布法獲得該藻的純培養藻株，再將藻株進行海水馴化，保藏于中國科學院南海海洋研究所海藻資源與生物技術實驗室，藻種編號為SCSIO-45821。

1.1.2 培養條件 微藻培養于光徑為3.0 cm、長度為60 cm、有效培養體積為320 mL的柱式光生物反應器中，培養溫度為25±1℃，熒光燈提供單側光源，培養光強為300 μmol·photons/m2s，連續鼓入二氧化碳加富的壓縮空氣提供碳源和攪拌（CO2∶Air，1∶99）。所用培養基為15‰海水BG-11，用15‰海水按改良的BG-11培養基配方配制而得［8]。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 在15‰海水BG-11無氮培養基中，分別以硝酸鈉、尿素、碳酸氫銨為氮源，每種氮源設置3.5 mmol/L、5.9 mmol/L、17.6 mmol/L三種初始氮濃度（換算成N濃度相同），以光徑為3.0 cm的光生物反應器作為培養體系，在溫度為25℃，光強為 300 μmol·photons/m2s條件下，采用 24小時不間斷光照以及連續通入含1%CO2的壓縮空氣培養，培養時間為14 d，每2 d測定生物質濃度，第0天、第4天、第8天、第12天、第14天離心收取藻泥，冷凍干燥并測定總脂含量及脂肪酸組成。

1.2.2 測序方法和引物序列 提取該藻的DNA，采用18S rDNA基因引物，在PCR內擴增后測序，正向引物：CTGGTTGATCCTGCCAGT，反向引物：CACCTACGCAAACCTTGTTACGACTT。

1.2.3 生物質濃度的測定 利用干重法進行測定，取一定量的藻液，用預先在80℃烘箱中烘干至恒重的混合纖維濾膜（0.45 μm）進行抽濾，再將有藻細胞的濾膜放置在80℃烘箱烘至恒重，稱重，用減差法得到微藻細胞干重。

1.2.4 總脂的測定與分級 總脂的提取與含量的測定采取改良的Khozin-Goldberg方法［9]，利用Christie的方法［10]，將總脂分為中性脂、糖脂、磷脂。

1.2.5 脂肪酸的測定 稱取25 mg凍干藻粉于10 mL玻璃離心管中，加入2 mL 2% H2SO4無水甲醇∶甲苯（9∶1，V∶V），充入氮氣后，用80℃水浴攪拌1小時，再依次加入1 mL去離子水和1 mL正己烷，充分震蕩后3 500 r/min離心5 min，將上層有機相轉移至另一離心管中，氮氣吹干，再加入1 mL含有C17標準品的正己烷，并用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾至1.5 mL的小玻璃瓶中，最后利用氣相色譜儀測定脂肪酸。

1.2.6 產量計算 總脂產量（g/L）=Mt×Lt，Mt為收藻時微藻的生物質濃度（g/L），Lt為相對應的總脂含量（DW，g/L）。EPA 產 量（mg/L）=Mt×Ft×1000，Mt為收藻時微藻的生物質濃度（mg/L），Ft為收藻時微藻EPA絕對含量（DW，g/L）。

1.2.7 統計分析 本論文中所有圖表所示的平均值和標準偏差均由2個生物學重復和3個測定重復計算獲得；利用Origin 8.1和Excel對實驗數據進行分析（ANOVA）；采用S-N-K方法對不同處理組進行多重比較；用最小顯著性差異（LSD）分析樣品均值之間的差異，置信度為0.05。

2 結果

2.1 藻株的分子鑒定圖

該藻生長在海拔高、降水少、風沙大及植被稀少的黃土高原上，為了確定該藻的分類學特征，將其18S rDNA基因序列輸入到NCBI數據庫進行比對，得到與該藻基因序列相似度最大的藻株分別為波氏真眼點藻（EustigmatospolyphemCCAP 860/8）和大真眼點藻（EustigmatosmagnusSAG 2266），根據18S rDNA基因序列構建系統發育進化樹。如圖1所示，該藻株命名為真眼點藻SCSIO-45821。

2.2 不同氮源及濃度對真眼點藻SCSIO-45821生長的影響

如圖2所示，經過0-2 d的生長延滯期，從第2天開始，真眼點藻SCSIO-45821藻細胞在三種不同氮源中均開始迅速增長，第10天后，藻細胞生長變緩，在以尿素為氮源的培養基中，三種不同氮濃度下的藻細胞生物質濃度無明顯差異（P＞0.05），至第14天，3.5 mmol/L、5.9 mmol/L和17.6 mmol/L三種氮濃度處理組的生物質濃度分別為6.49 g/L、5.39 g/L和5.66 g/L。在以碳酸氫銨為氮源的培養基中，三種不同氮濃度下的藻細胞長勢差異明顯（P＜0.01），3.5 mmol/L、5.9 mmol/L和17.6 mmol/L三種氮濃度處理組的生物質濃度分別為5.72 g/L、6.48 g/L和7.07 g/L。在以硝酸鈉為氮源的培養基中，3.5 mmol/L、5.9 mmol/L和17.6 mmol/L三種氮濃度處理組的生物質濃度分別為6.73 g/L、6.76 g/L和5.93 g/L。由上述分析可知，真眼點藻SCSIO-45821在碳酸氫銨為氮源，濃度為17.6 mmol/L時，取得了高于其他氮源和氮濃度處理組的生物質濃度，為7.07 g/L。

2.3 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821總脂積累的影響

對不同氮源及氮濃度條件下藻細胞油脂進行提取和分析發現（圖3），整個培養周期內，真眼點藻SCSIO-45821的總脂含量均呈增加趨勢，但不同處理組之間的油脂積累規律存在明顯差異。三種氮源3.5 mmol/L組的油脂積累速率均高于5.9 mmol/L組和17.6 mmol/L組（P＜0.01），培養至第14天，尿素組總脂含量最高為63.2% DW，其次為硝酸鈉（60.5%DW）和碳酸氫銨（59.9% DW）。17.6 mmol/L條件下，至培養結束均未超過35.0% DW。

圖1 基于18SrDNA基因序列對該藻構建的進化樹

圖2 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821生長的影響

圖3 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821油脂積累的影響

2.4 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821脂類組分的影響

按照總脂分級方法，對實驗獲得的總脂進行分級，結果如圖4所示，隨著氮濃度的降低及培養時間的延長，真眼點藻SCSIO-45821的中性脂比例也隨之增加。培養至第14天，三種氮源條件下，3.5 mmol/L處理組的中性脂比例顯著高于17.6 mmol/L處理組，然而與5.9 mmol/L處理組相比無明顯差異（P＞0.05），尿素、碳酸氫銨和硝酸鈉在3.5 mmol/L條件下的中性脂比例分別為79.0% TL（Total lipid）、77.0% TL和75.7% TL，而它們在17.6 mmol/L條件下的中性脂比例均未超過70% TL。

2.5 不同氮源及濃度對真眼點藻SCSIO-45821脂肪酸組成的影響

真眼點藻SCSIO-45821脂肪酸組成顯示，該藻的脂肪酸主要包括：C14∶0（豆蔻酸）和C16∶0（棕櫚酸）兩種飽和脂肪酸，C16∶1（棕櫚油酸）和C18∶1（油酸）兩種單不飽和脂肪酸以及C18∶2（亞油酸）、C20∶4（Arachidonic acid，AA）和C20∶5（eicosapentaenoic acid，EPA）三種多不飽和脂肪酸，其中C16∶1的含量遠高于其他脂肪酸。在三種不同的氮源組分中，隨著氮濃度的升高，真眼點藻 SCSIO-45821細胞中 C14∶0、C16∶1和 C18∶1的 百 分 含 量 下 降，C16∶0、C18∶2、C20∶4和C20∶5（EPA）的含量上升（表1），在以硝酸鈉為氮源的處理組中，17.6 mmol/L條件下C20∶5（EPA）的百分含量最高，為7.18% TFA（Total fatty acid），尿素氮源次之（6.20% TFA），最小為碳酸氫鈉（4.82% TFA）。

圖4 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821總脂組分的影響

2.6 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821總脂及EPA產量的影響

培養至14 d，真眼點藻SCSIO-45821總脂和EPA產量如表2所示，該藻株在低氮組和高氮組中的總脂產量差異明顯（P＜0.01）。隨著氮濃度的升高，該藻的總脂產量降低，低氮條件下總脂產量最高。在低氮條件下，以尿素為氮源的培養基中的該藻油脂產量最高，為4.18 g/L，在高氮條件下該藻的總脂產量僅有1.64 g/L。本實驗結果表明，在3.5 mmol/L條件下，以碳酸氫銨和硝酸鈉為氮源培養的該藻總脂產量分別為3.42 g/L和4.07 g/L，可見尿素可作為該藻生產油脂的最佳氮源。EPA的產率隨氮濃度的升高而升高，該藻在氮濃度為17.6 mmol/L硝酸鈉的培養基中EPA產量最高，為85.71 mg/L。

3 討論

3.1 不同氮源及濃度對真眼點藻SCSIO-45821生長的影響

氮源是微藻生長所必需的營養元素之一［11-12]，本研究結果顯示，在以碳酸氫銨為氮源的實驗組中，真眼點藻SCSIO-45821在17.6 mmol/L處理組中的生物質濃度高于其在3.5 mmol/L和5.9 mmol/L處理組中的生物質濃度，與已有實驗結果相符［13]。而在以尿素和硝酸鈉為氮源的實驗組中，SCSIO-45821藻株的生長隨著濃度的降低而得以顯著提高，3.5 mmol/L最低濃度組遠高于高濃度17.6 mmol/L處理組，這一現象較為罕見，造成這一現象的深層機制還有待進一步考究。

表1 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821脂肪酸組成的影響

3.2 不同氮源及濃度對真眼點藻SCSIO-45821總脂及脂肪酸積累的影響

低氮脅迫可誘導該藻積累油脂，本實驗結果顯示，三種氮源中3.5 mmol/L組的油脂積累量均高于5.9 mmol/L組和17.6 mmol/L組。有報道指出，在氮饑餓（3.5 mmol/L和5.9 mmol/L）條件下，藻細胞因缺少氮元素而抑制蛋白質合成，從而使微藻細胞內的碳流向油脂轉化，而在高氮（17.6 mmol/L）條件下，微藻細胞可以正常分裂，細胞內碳流向蛋白質積累轉化，油脂含量降低［14]。本實驗設置的三種氮源中，低氮組的油脂含量均顯著高于高氮組，這一結果與已有的文獻報道結果一致［15-16]。而由于低氮組細胞生長均高于高氮組，該藻株在硝酸鈉和尿素為氮源低氮組培養中，其油脂產量均顯著高于碳酸氫銨組的最大油脂產量，其中低濃度尿素更為適宜油脂生產。目前已知的大多數微藻在低氮條件下大幅提高油脂含量，但同時也顯著抑制生長，導致油脂產量不高甚至降低，因此，這一現象對微藻油脂的高效積累具有重要意義，具有進一步探索的價值。

表2 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821總脂及EPA產量的影響

本研究還發現，三種氮源中，隨著氮濃度的升高，SCSIO-45821藻株EPA含量也隨之升高，在以硝酸鈉為氮源的處理組中，17.6 mmol/L條件下C20∶5（EPA）的百分含量最高，為7.18% TFA，在3.5 mmol/L條件下EPA百分含量僅為1.79%（表1）。有文獻報道，真眼點藻的EPA存在于細胞膜脂上［17-18]，低氮條件下，中性脂含量均大幅提高，膜脂降解程度高，因此高氮條件下會獲得更高的EPA含量，本研究結果表明，高濃度的硝酸鈉條件更宜于SCSIO-45821藻株的EPA積累。

3.3 真眼點藻SCSIO-45821的耐高鹽性及潛在價值

SCSIO-45821藻株細胞內含有豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸以及二十碳五烯酸（EPA）等7種脂肪酸，其中棕櫚油酸的含量最高，占總脂肪酸的50%以上，該藻株脂肪酸組成與類波氏真眼點藻基本一致［19]。在低氮條件下，該藻株的油脂產率高、中性脂比例高，流動性好，在食用油脂及生物能源行業具有極大的開發前景。而其EPA產量隨著氮濃度的升高呈上升趨勢，最高含量達1.59%（占干重），最高產量達到85.71 mg/L。EPA具有很好的保健功能［20]，降低人患心腦血管疾病的風險以及抗癌抗腫瘤等作用［21-22]。此外，棕櫚油酸占該藻總脂肪酸的50%以上，棕櫚油酸具有抗炎，改善皮膚色澤和緩解肥胖癥等作用［23-24]，因此，該藻在醫藥保健品及化妝品行業具有極大的開發應用價值。

隨著我國耕地資源和淡水資源的日益緊缺，利用海水以及灘涂、鹽堿地建立微藻規?；B殖技術具有重要意義。SCSIO-4582藻株具有良好的耐高鹽性，在15%-20‰的海水中能夠正常生長，可望作為海水新資源藻種，開發前景廣闊。

4 結論

低氮（3.5 mmol/L）脅迫真眼點藻SCSIO-45821積累油脂，以尿素為氮源更有利于該藻積累油脂；高氮（17.6 mmol/L）有利于誘導真眼點藻SCSIO-45821的EPA的積累，并且以硝酸鈉為氮源可獲得較高產量的EPA，運用不同的氮濃度可誘導真眼點藻SCSIO-45821積累不同的高值化產品，因此，該藻具有極大開發應用潛力。