天山雪蓮SikCML7的克隆及表達分析

劉兆書 劉元元 秦玉杰 畢權 王賽賽 祝建波

（新疆石河子大學生命科學學院，石河子 832000）

在自然環境中，植物需要面對復雜多變的生存條件，因此，它們進化出復雜的機制來感知并響應環境的變化，以便更好地生存和繁殖。為了更方便、快速地傳遞感知信息，植物使用Ca2+作為第二信使。在感受到外界刺激后，細胞質中游離的Ca2+水平增加，充當攜帶特定信息的信號，被下游效應器感受到并產生生理生化反應。許多外源和內源因素（包括光、溫度、干旱與鹽脅迫病原體衍生的分子和植物激素等）都會引起植物細胞質內不同區域的游離Ca2+水平的升高［1]。

天山雪蓮（Sasussured involucrata）生長于天山山脈的陡峭山壁，是一種新疆特有的名貴中草藥［2]。由于生長在高海拔地區，天山雪蓮進化出獨特的生理生化機制來適應高寒、低氧、強輻射和晝夜溫差巨大等多種極端的生存環境。天山雪蓮作為一種抗逆性極強的植物，但人們對其抗逆機理仍然知之甚少。深入挖掘天山雪蓮的抗逆機制可以為研究植物逆境響應機理、提高經濟作物的逆境適應力提供新的思路。

CaM是一種典型的Ca2+傳感器，可以與多種蛋白質相互作用并調節其活性。它由2個球狀區域組成，每個區域都有一對EF-hand，由一個螺旋區域相連接［3]。Ca2+與EF-hand結合誘導蛋白質疏水表面的暴露，形成結合下游效應因子的高親和力結合位點。與CaM類似，CMLs主要由EF-hand組成，缺少其他已知的功能域。大多數CML（擬南芥中的31種，水稻種的20種）與鈣調素一樣具有4個EF-hand，但大部分的類鈣調素蛋白與鈣調素蛋白的同源性小于50%［4]。CML家族的蛋白質一級結構差異巨大，這表明它們在結合和識別Ca2+、激活下游目標等方面具有獨特的性質。盡管EF-hand結構域的序列差異巨大，但在Ca2+存在下的電泳遷移率變化表明CMLs是Ca2+傳感器。包括激酶和轉錄因子在內的多種蛋白質已被鑒定為CML結合蛋白，植物細胞中CML與靶蛋白以及蛋白質間特異性的相互作用已見報道，這表明CML可以通過調節自己的靶標蛋白發揮其獨特的功能［5]。同種植物中存在不同的CaM和CML蛋白，在感受和鑒別不同環境刺激的Ca2+信號中均起到了重要的作用，但到目前為止，其具體的機理機制仍未被闡明。

通過對擬南芥AtCML9的研究顯示該蛋白含有151個氨基酸，與典型的CaM蛋白具有46%的序列同一性。該蛋白作為一種轉錄因子，響應鹽、低溫、水分、干旱等各種刺激，并貫穿整個發育過程，作為ABA信號通路中的一種負調控因子調控擬南芥的脅迫應激和生長發育［6]。但在許多非模式植物中，對類鈣調素蛋白功能的研究鮮見報道。

本研究以天山雪蓮低溫轉錄組數據庫為基礎，采用RT-PCR方法從天山雪蓮中克隆CML基因家族SiCML7，并對其進行生物信息學分析及低溫脅迫下的定量表達分析，以期為開展抗逆基因工程提供有效的基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

天山雪蓮（S.involucrataKar.et kir）試管苗由石河子大學農業生物重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1SiCML7的克隆使用總RNA提取試劑盒（天根）提取天山雪蓮RNA，利用EasyScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（全式金）反轉錄成cDNA。根據石河子大學農業生物重點實驗室得到的天山雪蓮葉片低溫轉錄組數據設計特異性引物（SikCML7-UP：5'-TTGTCGAAGATGGTTGAAGGA-3'和SikCML7-DOWN ：5'-TTGTTTACGAGGCACTCATCA-3'），擴增SiCML7的開放閱讀框（ORF）序列，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收、連接，挑選陽性克隆測序，測序成功后將其命名為pMD19-T-SikCML7質粒。

1.2.2SikCML7生物信息學分析利用NCBI在線Blast尋找同源序列；利用DNAMAN進行序列分析，搜索開放閱讀框ORF；利用DANMAN和MEGA軟件進行多序列比對和進化樹分析；采用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預測SikCML7的分子量、氨基酸組成、等電點以及疏水性等理化性質；利用NCBI CDD以及Interproscan（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）對蛋白質的保守功能結構域進行分析；使用PSORT Prediction（http：//psort1.hgc.jp/form.html）預測蛋白質的亞細胞定位；使用ProtScale（https：//web.expasy.org/）對SikCML7蛋白的親/疏水性進行分析［7]。

1.2.3SikCKL7在不同脅迫條件下的表達分析低溫處理：將天山雪蓮組培苗分別放入4℃和-2℃的低溫光照培養箱中培養，并在1、3、6、9、12和24 h分別取樣，-80℃保存備用。干旱處理：將天山雪蓮組培苗置于20% PEG6000溶液中，并置于20℃光照培養箱中培養，在1、3、6、9、12和24 h分別取樣備用。鹽脅迫處理：將天山雪蓮組培苗放置于含150 mmol/L NaCl的MS固體培養基中置于20℃的光照培養箱中培養，1、3、6、9、12和24 h分別取樣備用。分別提取不同處理雪蓮樣本的RNA，并反轉錄為cDNA，置于-20℃備用。選擇天山雪蓮看家基因GADPH作為內參基因，并設計引物GAPDH-up：5'-TAGCAAGGATGCTCCCATGTTCGT-3'和GAPDH-down：5'-AAAGGAGCAAGGCAGTTGGTTGTG-3'；根據測序結果，設計SikCKL7引物SikCKL7-up：5'-GG TACCTTGTCGAAGATGGTTGAAGGA-3'和SikCKL7-down：5'-TCTAGACGAGGCACTCATCATAACC-3'。參考SYBR GreenⅠ Master Mix試劑盒說明書進行qRT-PCR反應，采用2-ΔΔct法對數據進行分析。

2 結果

2.1 SikCML7的克隆與同源序列比對

根據天山雪蓮低溫轉錄組數據檢索到的SikCML7序列，并設計PCR引物，以天山雪蓮cDNA為模板，獲得到一條長度約500 bp的條帶。經測序，其長度為450 bp。生物信息學分析表明其編碼一條149個氨基酸的蛋白質序列，蛋白質預測結果表明，該蛋白的相對分子質量為17.14 kD，等電點為4.00。NCBI CDD以及interpro保守型分析表明其編碼一個屬于Penta-EF-hand（PEF）超家族的EF-hand結構域；含有4個鈣離子結合位點，分別位于第21-33、57-69、93-105和129-141氨基酸。

圖1 雪蓮SikCML7與其他物種氨基酸多序列比對

使用PSORT Prediction對SikCML7蛋白進行亞細胞定位預測分析，結果顯示，有65%的可能性定位在細胞質內，有10%的可能性定位在線粒體基質內，有10%的可能性定位在溶酶體腔內，說明SikCML7是一種胞內蛋白，且定位在細胞質基質內。對SikCML7進行Blast檢索，獲得16個相似度極高的序列，使用DANMAN進行多序列比對，結果（圖1）顯示，其同一性為81.16%，其中83-98、123-141區域相似度較高，而其余區域的相似度較低，可能由于植物CML的功能區域位于N末端。同時也表明，不同物種間的CML基因在功能上存在一定的差異。

2.2 SikCML7系統發育樹分析

在Tair上搜索并下載AtCMLs氨基酸序列，使用MEGA7和NJ法進行進化樹構建。結果（圖2）顯示，雪蓮SikCML7蛋白同AtCML9在同一進化枝上，表明SikCML7與AtCML9的親緣性較近。

圖2 SikCML7與擬南芥CMLs的系統進化樹

2.3 SikCML7在不同脅迫條件下的表達模式

通過對天山雪蓮進行不同脅迫處理，利用熒光定量PCR法檢測SikCML7的表達情況。在4℃處理時，SikCML7表達量在脅迫初期急速上升，約為對照組的116倍，之后隨著時間的推移其表達量逐漸下降，并在24 h后達到最低。在-2℃處理時，隨著時間的推移，其表達量在脅迫初期呈上升趨勢，并在6 h時表達量達到最高，約為對照組的20倍，之后其表達量隨脅迫時間逐漸下降（圖3）。

在干旱脅迫下，SikCML7表達量逐漸上升，在6 h時達到最大值，之后表達量逐漸下降，最終回到正常值（圖4）。

在鹽脅迫時，SikCML7表達量在脅迫初期不變，3 h時表達上調，且在接下來的9 h內表達量均很高，24 h后恢復常態（圖5）。

結果表明，SikCML7面對脅迫時，可以在短時間內快速作出反應，并調整自身的生理狀態，以適應逆境環境。

圖3 低溫脅迫下天山雪蓮SikCML7的表達模式

圖4 干旱脅迫下天山雪蓮SikCML7的表達模式

圖5 鹽脅迫下天山雪蓮SikCML7的表達模式

3 討論

CMLs是存在于高等植物中重要的Ca2+結合蛋白，在細胞Ca2+信號傳導途徑中扮演著重要的角色。CML含有1-6個不等的EF-hand手型結構域，除此之外，沒有其他已知的功能結構域［8]。研究表明，含有EF-hand的CMLs在植物的生長發育和逆境響應中都有著重要的作用，例如AtCML15和AtCML16參與開花的過程［9]；AtCML36定位在花粉管，參與植物自身的Ca2+調節［10]；AtCML38是缺氧反應核心鈣傳感蛋白［11]；AtCML42通過茉莉酸途徑充當植物防御的負調節因子［12]；AtCML37通過脫落酸途徑參與植物干旱脅迫的響應［13]；AtCML24通過調控NO進而調控植物光周期和開花［14]；AtCML9通過ABA通路調控植物的低溫抗性［15]等。此外，大量研究表明，CMLS對Ca2+與靶蛋白的結合具有選擇性。植物中存在著與類鈣調素蛋白結合的不同蛋白激酶，它們在不同的生理條件下被特異性調控，具有不同的作用機制和生理功能［16]。

擬南芥CML家族有50個成員，水稻的CML家族有32個成員，由此可見CML是一個成員眾多的基因家族［17-19]。但是，迄今為止，對于不同基因的表達模式以及功能分析還未得到深入發掘，因此，關于類鈣調素蛋白家族的生理和生化功能還有待進行更加深入的研究。

天山雪蓮作為一種具有高度抗寒性的植物，其生理功能及抗寒機制的研究還很淺薄。且多數實驗主要集中在功能基因的研究上，而對于信號分子的研究幾乎為空白。作為植物信號通路中極為重要的一環，CMLs在天山雪蓮的抗逆過程中扮演著十分重要的角色。在石河子大學農業生物重點實驗室先前研究的基礎上，根據天山雪蓮的低溫轉錄組數據，本研究獲得到了天山雪蓮SikCML7基因，其編碼149個氨基酸，有4個EF-hand手型結構域。系統進化樹分析其與AtCML9親緣性最近，BLAST分析及多序列比對則顯示出其與向日葵擁有最高的相似度，且均含有EF-hand手型結構域，因此，推測兩者在功能上可能具有一定的相似性，此外，SikCML7是一個EF-hand的家族成員。

實時熒光定量PCR結果表明，CMLs能夠參與植物的逆境應激響應。天山雪蓮經過不同的低溫處理之后，其表達量均有顯著的提高，但是其表達模式卻存在明顯的差異。在4℃脅迫條件下，SikCML7在脅迫初期表達量瞬時上升，隨著時間的推移，其表達量逐漸下降。這可能是由于在冷害初期，外界冷信號迅速激活雪蓮的低溫應激反應，SikCML7在上游信號分子的調控下，表達量迅速上升；之后，隨著雪蓮對低溫脅迫的適應，導致SikCML7的表達量逐步趨于正常。在-2℃脅迫條件下，SikCML7表達量逐漸上升，在6 h時表達量達到峰值，之后又表達下降。在經過PEG和NaCl處理后，其表達量均在初期就有上升，之后隨著脅迫的持續基因表達維持一段時間，之后表達量恢復到正常水平。大量研究表明，ABA作為一種重要的植物激素，在于植物抵抗逆境的過程中起著重要的作用［20]，而類鈣調素蛋白家族積極參與植物ABA通路的響應［21-22]。雪蓮SikCML7與擬南芥AtCML9的親緣性最高，AtCML9通過ABA通路調控植物抗逆。因此，推測SikCML7通過ABA途徑調控雪蓮的逆境響應。植物在冷害下，細胞滲透壓上升，細胞保水性增加，從而降低低溫所帶來的損傷［23]。在凍害時，細胞內水分需要快速外排，防止胞內水分形成冰晶，從而降低冰晶形成所引起膜破壞損害［24]。因此，植物在應對冷害和凍害需通過不同的機制調節達到整個低溫狀態的適應。有研究表明，擬南芥中的CML家族成員可以通過調控鈉離子泵AtNHXs基因來調節細胞的滲透平衡，從而調節細胞的含水量以適應不同溫度所帶來的生理生化反應的變化［25]。據此推測SikCML7可能通過調控NHX來調節細胞的滲透壓，因此造成了SikCML7在不同低溫環境下的表達模式差異。同時，AtCML與AtNHX之間的相互作用表明在液泡中存在Ca2+-pH依賴性的信號組分，可以參與植物對鹽脅迫和干旱的響應。研究表明，甲基乙二醛作為糖酵解的副產物，是植物暴露于高鹽環境下所產生的毒害物質之一，通過乙二醛酶Ⅰ和乙二醛酶Ⅱ可以有效解毒。乙二醛酶Ⅰ是一種鈣依賴性蛋白，其酶學功能受到Ca2+/CaM的影響［26-27]。此外，有報道表明CML37、CML38和CML39也對鹽、干旱和ABA刺激有反應，推測可能參與到植物滲透脅迫耐受［28]。

4 結論

SikCML7可能參與天山雪蓮的脅迫響應過程，且對低溫脅迫響應尤為強烈。