桃PpNAC72的克隆及表達分析

武肖琦 馮濤 劉艷軍 焦思鵬 孫攀 楊靜慧

（天津農學院園藝學院，天津 300384）

桃（Prunus persica） 是世界上栽培廣泛的落葉果樹之一，世界桃產量一直呈上升趨勢，其中中國占一半以上。迄今為止，桃樹在中國已有3 000多年的栽培歷史，全國各地的栽培品種1 000多個［1]，具有重要的商業價值。桃作為重要的經濟果樹之一，其果實品質的好壞與成熟期的早晚直接影響果農的經濟效益。

NAC基因家族是植物基因組中含量極其豐富且植物特有的最大轉錄因子家族之一。最早是在矮牽牛NAM、擬南芥AATF1/2和CUC2蛋白的N端被

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為‘津柳早紅’，成熟期在6月上旬，屬于極早熟桃品種。于2018年4月至6月，采取‘津柳早紅’的花蕾、葉片、莖、根及果實；于2018年發現的一段高度保守的氨基酸序列，Aida等［2]將其命名為NAC結構域，并將包含NAC結構域的蛋白稱為NAC轉錄因子。迄今為止，已經預測或鑒定出許多來自不同植物的NAC基因，主要有玉米（Zea mays）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）、高粱（Sorghumbicolor）、番木瓜（Caricapapaya）［3]以及大豆（Soybean）［4]等。同時還有研究表明NAC家族具有非常重要的生物學功能，如廣泛參與花的成熟［5]、木纖維的形成［6]、側根的發育［7-8]、植物的抽枝［9]、植物的衰老［10-11]以及影響激素信號的傳導［12-14]等，在各種發育過程和逆境應答中起非常重要的調節作用。

桃果實成熟受多因素影響，包括環境、生長素及基因型等。Bailey等［15]推測桃果實成熟期共受3個位點的6個累加基因的控制，其中每個貢獻基因控制大概15 d的成熟期，例如基因型Sm1Sm1Sm2Sm2Sm3Sm3比Sm1Sm1Sm2Sm2Sm3sm3早成熟15 d，基因型sm1sm1sm2sm2sm3sm3比sm1sm1sm2sm2Sm3sm3晚成熟15 d，但景士西等［16]認為此說法尚缺乏試驗證據進行支持。Eduardo等［17]研究發現，編碼NAC家族的轉錄因子候選基因ppa008301m（PpNAC72）是植物中NAC基因家族中的一員，MD基因座的精細定位［18]鑒定出ppa008301m（PpNAC72）作為可能的至熟基因在轉錄水平上調節基因表達，在調節植物生長發育過程中起著非常重要的作用。

近年來，對桃NAC基因家族的研究取得了一定進展，但對于桃成熟相關分子的作用機制有待于進一步研究。本研究基于前期對影響桃成熟期基因的篩選與研究，以‘津柳早紅’為材料，通過RT-PCR技術克隆獲得PpNAC72，并對其進行生物信息學分析。利用實時熒光定量PCR檢測該基因在不同器官和不同時期的表達變化，為更好地研究桃果實成熟的機制提供理論與實驗支持。4月下旬至6月中旬，每隔8 d取‘津柳早紅’各時期的果實。試驗材料均采自天津市大柳灘桃園基地，材料經液氮中速凍后于-80℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據桃參考基因組（https：//www.rosaceae.org/）中的ppa008301m序列，使用Primer 5.0設計引物，NAC-F1：5'-GGAATTCCATAT GGCTCTCTTTCTTTCTCTC-3'，NAC-R1：5'-TAACCC GGGACTACTCGATTTCTCCAC-3'（下劃線處分別為NdeⅠ和SmaⅠ酶切位點），均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 桃總RNA提取及cDNA的合成 根據植物總RNA快速提取試劑盒EASYspin Plus（Aidlab，北京）說明書提取葉片、花蕾、果實、根、莖的RNA，并使用Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，中國大連）合成cDNA。

1.2.3PpNAC72的克隆 以‘津柳早紅’cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系為cDNA模板1.0 μL、5×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、5 U/μL rTaq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 正、反向引物各 1.0 μL 和dd H2O 17.3 μL。擴增程序為 94℃ 3 min ；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個循環 ；72℃ 8 min，4℃保存，PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收，并與pEASY-Blunt載體連接，轉入大腸桿菌感受態細胞。篩選陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4PpNAC72的qRT-PCR分析 提取‘津柳早紅’根、莖、花、葉以及不同時期果實的RNA，并反轉錄成cDNA。使用Primer 5.0引物設計軟件，根據序列非保守區設計引物，qPCR-F1：5'-GTCGTCTTCC TGCTCGTCTCA-3'和 qPCR-R1：5'-TCACATTCATT TGCCCTTGG-3'，產物長度為245 bp。內參基因RPⅡ（RNA polymeraseⅡ）上游引物F2：5'-TGAAGCAT ACACCTATGATGATGAAG-3'，下游引物R2：5'-CT TTGACAGCACC-AGTAGATTCC-3'［19]。根據 iTaq Universal SYBR Green Supermix操作說明，以RPⅡ為內參基因，利用BIO-RAD CFX96熒光定量PCR儀（伯樂，美國）進行qRT-PCR擴增。實時熒光定量PCR反應體系為：iTaq Universal SYBR Green Supermix 10μL、上游引物（qPCR-F1/RP II-F2）1 μL、下游引物（qPCR-R1/RP II-R2）1 μL、cDNA 模板 1 μL、ddH2O補至20 μL。qRT-PCR反應程序為95℃ 3 min；95℃5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環，每個樣品3個重復。采用2-ΔΔCt法進行數據分析，計算不同器官和不同時期PpNAC72的表達量。

1.2.5PpNAC72的生物信息學分析 利用NCBIBLAST對獲得的目的片段進行同源性比對，利用Bioedit進行氨基酸序列分析，并利用MEGA 6.0構建PpNAC72系統發育進化樹。進一步利用在線工具 expasy（http：//web.expasy.org/compute_pi/） 推測該蛋白的等電點，并利用expasy上的ProtParam工具對PpNAC72所編碼的氨基酸序列進行親水性分析。利用在線工具SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽分析，利用在線工具 TMHMM v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行跨膜結構域分析，利用在線 工 具 PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）進行蛋白質的二級結構分析，利用Swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）預測蛋白質的三級結 構。 通 過PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行啟動子元件分析。

2 結果

2.1 PpNAC72的克隆

從‘津柳早紅’果實中提取RNA，反轉錄得到cDNA后使用特異性引物PCR擴增得到約1 100 bp的片段（圖1）。結果表明，該基因全長編碼序列為1 050 bp，編碼349個氨基酸，BLAST結果（圖2）顯示，該基因含有個1個NAM結構域，從N端第15-139氨基酸。此基因命名為PpNAC72。經序列對比，發現目的基因比桃參考基因組中的該基因多出一段長度為36 bp的片段（圖3）。

圖2 PpNAC72蛋白中NAM結構域分析

圖3 PpNAC72的同源性分析

圖1 桃RNA檢測（A）和PpNAC72的擴增（B）

2.2 PpNAC72的蛋白理化特性

PpNAC72所編碼的蛋白質分子量為39.2 kD，等電點為8.34，不穩定系數為39.14，為穩定蛋白。親水性分析表明，親水性氨基酸為153個，占43.9%；疏水性氨基酸為142個，占40.6%，平均疏水系數為-0.623，為親水性蛋白，其中，親水性最高的氨基酸是第78位的精氨酸（Arg，R），其親水指數位-2.800。氨基酸組成中帶有負電荷的氨基酸（Asp+Glu）共有37個，占10.6%；帶有正電荷的氨基酸（Arg+Lys）共有40個，占11.5%。該蛋白沒有跨膜區域，非膜蛋白。該蛋白的二級結構預測結果表明，桃樹PpNAC72蛋白的二級結構中α-螺旋結構占3.44%，β-折疊結構占14.04%，環肽鏈占82.52%。PpNAC72蛋白的三級結構見圖4。

圖4 PpNAC72蛋白的三級結構預測圖

2.3 啟動子元件分析

啟動子是基因的一個重要組成部分。選取PpNAC72起始密碼子上游2 000 bp進行啟動子元件分析，發現啟動子和增強子區域中常見的順式作用元件——CAAT-box、參與脫落酸反應作用的順式作用元件（如ABRE）、參與光響應的元件（如G-Box、Box 4和ATCT-motif）、與生長素相關的響應元件（如TGA-element）。結果表明，PpNAC72可能參與多重激素調控果實成熟的響應。

2.4 PpNAC72的組織特異性分析

‘津柳早紅’不同器官的熒光定量PCR檢測結果（圖5）表明，PpNAC72在所有被檢測的器官（包括營養器官以及生殖器官）中都有不同程度的表達。在果實中表達量最高，在根部、花朵中相對較少，在根部表達量最低。

該基因在不同時期果實中的表達量隨著果實的成熟不斷增加，在果實生長階段中后期表達量達到最高，其表達量是前一個時期的3倍，并且遠遠高于其他時期；隨后表達量降低，但在果實接近成熟時基因表達量增加（圖6）。

圖5 PpNAC72的組織特異性分析

圖6 PpNAC72在不同時期果實中的表達量分析

2.5 PpNAC72的同源性分析及系統進化分析

將桃的轉錄因子PpNAC72與甜櫻桃（Prunus avium，XP_021809122.1）、 梅（Prunus mume，XP_008226676.1）、野草莓（Fragaria vesca subsp. Vesca，XP_004291667.1）、 月 季（Rosa chinensis，AKC884 81.1）、 白 梨（Pyrus x bretschneideri，XP_00937849 2.1）、 蘋 果（Malus domestica，ADL36797.1、 川 桑（Morusnotabilis，XP_010089503.1）、湖北海棠（Malus hupehensis，AGS08773.1）、山黃麻（Tremaorientalis，PON45671.1）、 可 可（Theobroma cacao，EOY 12853.1）、 胡 桃（Juglans regia，XP_018851445.1）、甜橙（Citrus sinensis，XP_006464708.1）等物種的NAC家族氨基酸序列進行多重序列比對，發現桃樹的PpNAC72與甜櫻桃同源性最高，達96%，與樹棉（Gossypium arboreum，XP_017605223.1）最低（圖7）。利用Neighbor-Joining法構建系統進化樹，結果（圖8）表明，桃的轉錄因子PpNAC72與甜櫻桃和梅的NAC轉錄因子位于同一進化分支，親緣關系最近，與其他植物的NAC轉錄因子親緣關系較遠。

3 討論

NAC類轉錄因子是一類植物中特有的轉錄因子，該類轉錄因子具有自身的結構特點：其N端含有約150個氨基酸組成的高度保守NAM結構域，并且在該結構域中含有A、B、C、D和E 5個亞結構域［20]。而且，NAC類轉錄因子C端一般特異性很高，具有轉錄激活功能［21-22]，此外C端還富含絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等。另有研究表明，含有60個殘基的NAM結構域，是由包圍著一些螺旋狀元件的一個扭曲的β-折疊組成［23]。絕大多數NAC基因僅有1個NAM結構域，少數含有2個NAM結構域，且大多數NAM結構域兩端基本都具有保守基序［24]。

圖7 桃樹PpNAC72蛋白與其他物種中NAC蛋白的氨基酸序列比對

圖8 桃樹PpNAC72蛋白與其他物種NAC蛋白的聚類分析

本實驗通過RT-PCR技術，獲得了PpNAC72的開放閱讀框編碼序列，利用生物信息學對所獲得的PpNAC72氨基酸序列分析顯示：該蛋白具有一個NAM結構域，位置從N端第15-139氨基酸，其二級結構中α-螺旋結構占3.44%，β-折疊結構占14.04%。該基因的蛋白C端富含絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等，與NAC轉錄因子編碼的蛋白質特點一致。使用Bioedit對桃PpNAC72的氨基酸序列比對，發現該轉錄因子與其中與甜櫻桃NAC同源性最高，與其他物種的NAC蛋白同源性比對均在96%-70%，說明桃PpNAC72相對保守。

經多項研究發現，在擬南芥、番茄等模式作物上調控果實成熟的NAC轉錄因子較多，擬南芥中與果實成熟相關的NAC基因已有報道，乙烯信號轉導途徑中的下游轉錄因子基因AtNAC2可以被乙烯合成前體ACC誘導，推測該基因是乙烯和生長素信號傳導途徑中的一個下游基因，該基因超表達促進轉基因植株的側根生長，同時具有明顯的耐鹽性［8]。在擬南芥中發現的NAP轉錄因子在調控植物生長發育、葉片衰老、響應生物和非生物脅迫等方面有重要作用，NAP轉錄因子不僅與葉片衰老有關，也與果實衰老緊密相關［25]。Liu等［26]研究發現甜橙的CitNAC在其成熟期和衰老期的果實中均有相應的表達，預示著CitNAC可能調控甜橙果實的成熟衰老。擬南芥的3個NAC基因RD26/ANAC072、ANAC019和ANAC055均受干旱、高鹽或低溫的誘導表達，證實ANAC072參與脅迫響應和ABA信號傳導途徑［27]。馬鈴薯StNAC72可能參與干旱及水分刺激信號傳導過程［28]。表明該基因在不同植物中的功能有所不同，在植物發育過程和逆境應答中均發揮作用，是一個多功能轉錄因子。

本研究通過從桃樹‘津柳早紅’中分離克隆轉錄因子PpNAC72，對其結構和功能進行初步分析，并且對桃各個器官的PpNAC72進行定量表達分析，結果表明，該基因在桃樹的各個部位均有表達，且在果實中的表達量達到最高，同時該基因的表達量在其生長期的不同時期有明顯變化，并呈現增加-減少-增加的趨勢。桃樹的果實發育分為3個時期：一是第一個迅速生長期，此期幼果縱徑生長迅速；二是緩慢生長期，即硬核期，此期果實生長較慢，主要是果核的硬化和胚胎的形成；三是第二個迅速生長期，此期細胞體積迅速膨大。PpNAC72的表達量隨著果實的生長不斷增加，在其果實生長階段的中后期表達量達到最高，此時果實可能處于迅速生長期；隨后表達量降低；但在果實接近成熟是時基因表達量增加，此時果實可能處于第二個迅速生長期。該基因的表達量的變化趨勢符合桃樹的生長規律，說明該基因極有可能參與果樹的生長發育，并有可能影響桃樹的成熟，為進一步研究該基因的功能奠定基礎。

4 結論

從桃樹中克隆獲得PpNAC72，其開放閱讀框1 050 bp，編碼349個氨基酸，具有一個NAM結構域，PpNAC72蛋白為親水性蛋白，非膜蛋白。PpNAC72與甜櫻桃同源性最高，親緣性最近。PpNAC72可能參與果樹的生長發育，并有可能影響桃樹的成熟。