基于CRISPR/Cas9加工番茄α-Man突變體的構建

張圓圓 邵冬南 崔百明

（石河子大學生命科學學院 石河子大學農業生物技術重點實驗室，石河子 832003）

番茄（Solanum lycopersicum）屬于呼吸躍變型果實，在成熟過程中乙烯產量驟增，果實迅速軟化，影響商業價值。因此，探索能夠抑制番茄果實過度軟化、延長貨架期、便利儲存運輸、增加銷售品質的方法顯得尤為重要［1-3]。Zhang等［4]研究表明果實的軟化主要由于整個成熟過程中果實細胞壁組分和結構的破壞，但確切機制仍不清楚。Roberts等［5]在植物細胞壁以及其他細胞器中均發現有糖基化的N-糖蛋白存在。并且在果實成熟前期，用衣霉素（蛋白質糖基化抑制劑）處理后，番茄紅素和類胡蘿卜素等相關營養成分的積累、葉綠素降解以及果皮組織產乙烯能力都受到抑制，這表明N-糖蛋白的糖基化在果實成熟過程中起重要作用［6]。游離N-聚糖作為糖基化的前體或N-糖蛋白水解產物，在果實成熟階段果皮組織中含量明顯增加［7]。糖苷水解酶（Glycoside hydrolase）作用于N-糖蛋白的各種糖苷或寡糖，使糖苷鍵水解形成游離N-glycans，而缺乏寡糖部分的蛋白質會直接影響果實細胞壁與細胞膜的化學組分，從而破壞細胞的完整性，導致果實軟化［8-9]。α-甘露糖苷酶（α-Man）切割糖蛋白中存在的高甘露糖型和植物復合型N-聚糖的末端α-甘露糖苷鍵，番茄α-Man在果實成熟時誘導表達，調節果實成熟軟化過程。過表達α-Man導致番茄果實過度軟化，而α-Man表達受抑制的RNAi植株，果實軟化速率下降，硬度增加，保質期延長［10]。

目前，對于降低番茄果實軟化程度的問題，通過RNAi抑制細胞壁修飾相關基因是最常用的方法，但果實風味嚴重受損［11-13]。Meli等［10]證明α-Man的RNAi植株果實成熟延緩，但營養成分不發生改變?；蚪M靶向修飾已成為改造基因組和研究基因功能的一個重要手段［14]。而基于CRISPR/Cas9系統的基因組編輯是使用最廣泛的基因編輯技術，它由Cas9核酸酶和靶向基因組序列的指導RNA（gRNA）組成，能夠簡單、精準、高效地編輯單個基因的一個或多個靶位點，甚至多個基因的多個位點［15]。已成功應用于多種模式植物和作物［16-18]。

本研究通過CRISPR/Cas9基因組編輯手段，靶向加工番茄N-糖蛋白水解關鍵酶基因α-Man。通過農桿菌介導的遺傳轉化獲得α-Man突變體植株，從而達到抑制N-糖蛋白降解、降低加工番茄成熟期果實軟化程度的目的，具有重要的生物學意義及商業價值。

1 材料與方法

1.1 材料

加工番茄（Solanum lycopersicum）品種里格爾（87-5）作野生型；由上海生工生物工程股份有限公司合成sgRNA表達框并完成測序工作。

1.2 方法

1.2.1 植物表達載體構建α-Man敲除靶點引物序列設計：首先根據加工番茄α-Man序列（EU244853），利用在線軟件CRISPR-PLANT（https：//www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html）篩選合適的編輯靶點。然后根據PAM（NGG）位點切割原則設計靶序列sg_Man_1S，并給出它的互補序列sg_Man_1A（表 1）。

表1 引物序列列表

載體構建：首先以hcas9-S/hcas9-A（表1）為引物擴增hCas9目的片段，并通過NcoⅠ/BstEⅡ克隆到pCAMBIA1302載體上，構建p1302-Cas9載體；用XhoⅠ酶切載體pBP-35S和p1302-Cas9，以Kan抗性基因替換載體骨架p1302-Cas9的Hyg抗性基因，構建pKAN-Cas9載體；然后將公司合成的sgRNA表達框（圖1）克隆到pUC19載體上，構建pUC-sgRNA載體；Hind Ⅲ/EcoRⅠ雙酶切載體pUC-sgRNA和pKAN-Cas9，構建pKAN-sgR-Cas9載體；最后通過引物退火的方式將sg_Man_1S/sg_Man_1A結合成帶黏性末端的雙鏈DNA片段，并利用Ⅱs型限制酶AarⅠ克隆到pKAN-sgR-Cas9載體上，構建植物表達載體pKAN-sgR-Cas9-Man（圖2）。

圖1 sgRNA表達框示意圖

測序正確的質粒電擊轉化根瘤農桿菌GV3101，通過菌落PCR篩選陽性克隆，活化單班用于番茄外植體侵染。

圖2 植物表達載體pKAN-sgR-Cas9-Man結構示意圖

1.2.2 加工番茄遺傳轉化 首先用2%次氯酸鈉溶液浸泡消毒（搖床內，120 r/min，10 min）番茄種子，并用無菌水漂洗8-10次，播種于1/2MS（MS鹽2.315 g/L+蔗糖15g/L+瓊脂7.0 g/L，pH5.8）培養基上。28℃暗培養2 d，待種子發芽后，28℃長日照（光照16 h/黑暗8 h）繼續培養3-4 d；然后取子葉中段、葉柄和莖段，平鋪在共培養基上（MS鹽4.43 g/L+蔗糖30 g/L+植物凝膠1.5 g/L+IAA 0.1 mg/L+ZT 0.5 mg/L，pH5.8）培養，28℃長日照培養2 d；再用AIM合成培養基（含100 μmol/L乙酰丁香酮）制備侵染液（OD600=0.6-0.8），侵染外植體10-15 min后，將其轉入表面鋪有一層薄濾紙的共培養培養基，24℃暗培養2 d；之后將外植體轉移至篩選培養基（MS鹽4.43 g/L+蔗糖30 g/L+植物凝膠1.5 g/L+IAA 0.1 mg/L+ZT 0.5 mg/L+Carb 300 mg/L+Kan 50 mg/L，pH5.8），28℃長日照培養。每隔10-15 d將外植體轉移至新的篩選培養基進行繼代培養，繼代培養3次。最后將分化再生得到的Kan抗性幼苗小心切下，并轉移到生根培養基（1/2MS培養基+IAA 0.1 mg/L+Carb 300 mg/L+Kan 50 mg/L，pH5.8）中誘導生根。當番茄幼苗生長至成株（10 cm左右）后，將其頂端生長點或芽尖（包含生長節點）切下轉移至擴繁培養基（1/2MS培養基+IAA 0.1 mg/L，pH5.8），待擴繁植株長出新葉，取少量葉片進行檢測。

1.2.3 轉基因植株分子鑒定 取1 g左右番茄葉片，SDS法提取番茄基因組DNA作模版，Colony-R和sg_Man_1A（表1）作引物，另加野生型番茄葉片基因組DNA作陰性對照，pKAN-sgR-Cas9-Man質粒（100×）作陽性對照，水作空白對照進行PCR鑒定。

1.2.4 番茄α-Man突變體檢測 以番茄葉片基因組DNA為底物，特異性檢測酶ScaⅠ進行酶切，回收純化酶切產物，以純化產物為模板，DT-Man-F和DT-Man-R（表1）為引物，野生型番茄葉片基因組DNA作陰性對照，PCR擴增加工番茄α-Man部分片段（包含靶序列）。擴增產物用瓊脂糖凝膠純化，進行TA克隆和菌落PCR鑒定，選擇正確的單克隆，提取質粒繼續進行酶切檢測，選擇鑒定正確的克隆測序。根據測序結果比對分析靶序列的編輯情況。

2 結果

2.1 CRISPR/Cas9基因編輯載體的構建

α-Man敲除靶點引物序列設計：α-甘露糖苷酶（α-Man）是植物體內N-聚糖加工的關鍵酶，參與N-聚糖形成和細胞壁合成。生物信息學分析表明番茄α-Man全長為11 001 bp，共含有30個外顯子和29個內含子。為獲得α-Man的移碼突變體，在α-Man第1外顯子上，起始密碼子ATG后170 bp處設計長度為18 bp的靶位點序列：5'-GGTCGATCAGTACTATGTTGG-3'，5'端是堿基G，與中間載體pKAN-sgR-Cas9經AarⅠ酶切后形成黏性互補末端，同時提高番茄U6啟動子（SlU6）的轉錄效率。靶序列3'端為PAM序列TGG，PAM前5個堿基處設有ScaⅠ內切酶識別位點（圖3），用于檢測α-Man突變體。

圖3 加工番茄α-Man靶序列設計示意圖

SlU6驅動sgRNA的表達載體構建：植物表達載體pKAN-sgR-Cas9-Man以pCAMBIA1302為載體骨架，分別使用NcoⅠ/BstEⅡ位點和HindⅢ/EcoRⅠ位點將Cas9和sgRNA以5'-3'方向插入pCAMBIA1302載體中。并通過AarⅠ將18 bp靶序列融合到gRNA支架的5'末端，由SlU6驅動sgRNA表達框，花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子驅動hCas9表達框。利用EcoRⅤ酶切鑒定表達載體，結果符合預期設計（圖4-A），同時對陽性克隆進行測序驗證，序列比對結果表明載體構建正確。

圖4 靶向α-Man載體構建

2.2 加工番茄轉基因陽性植株的獲得

試驗前期，試圖通過瞬時轉化的方法實現對加工番茄α-Man的編輯，但結果顯示靶序列并沒有發生突變。因此，選擇農桿菌介導的遺傳轉化方式來獲得加工番茄轉基因植株。圖4-B是質粒電擊轉化農桿菌菌落PCR鑒定結果，得到預期大小為374 bp的電泳條帶，說明質粒轉入農桿菌。

之后活化菌斑，經過加工番茄外植體制備、浸染、共培養和3次繼代培養，約30-40 d得到再生植株，20 d后擴繁成株，同時取樣提取基因組DNA。以Colony-R和sg_Man_1A為引物對上述樣品進行分子鑒定，結果有14株擴增出374 bp大小的特異性條帶，與陽性對照所得目的條帶大小一致，而陰性對照和空白對照均沒有擴增出條帶，說明檢測到14株轉基因陽性植株（圖5）。

圖5 轉基因番茄植株的PCR檢測結果

2.3 α-Man突變體檢測

將轉基因植株每20-30 d擴繁一次，共擴繁3次，待擴繁莖段生長至成株，進行酶切和PCR檢測，試驗預期發生突變的樣品可以擴增出704 bp的目的條帶，而沒有發生突變的樣品將和野生型對照一樣沒有特征條帶。檢測結果顯示有8個樣品擴增出704 bp的目標條帶（圖6）。

圖6 PCR擴增基因組DNA酶切產物

后期菌落PCR檢測證明只有4號和7號2個樣品可以擴增出目的條帶，選擇鑒定正確的14個單克隆進行測序，結果（圖7）顯示，在靶位點處有一個克隆發生52個堿基的缺失突變（克隆4-1，圖7-C），而其余13個克隆均發生單堿基突變，包括C-T轉換（克隆1-9，圖7-A）和A-G轉換（克隆4-1，圖 7-B）。

2.4 轉基因植株的表型觀察

通過對轉基因試管苗和α-Man突變體植株表型的觀察和記錄，發現與野生型加工番茄相比，它們的表型均無明顯差異，而且檢測到點突變和缺失突變的植株也沒有明顯的表型差異（圖8）。這與α-Man屬于果實成熟特異性表達蛋白的研究結果一致，在番茄生長發育各階段檢測不到α-Man酶活性，所以植株沒有明顯的性狀。

圖7 α-Man突變體靶位點編輯效應測序結果

圖8 轉基因植株表型

3 討論

細胞壁修飾相關蛋白α-Man主要參與蛋白質糖基化修飾、糖蛋白聚糖水解修飾和復雜N-聚糖的合成以及果實成熟軟化，被認為是破壞細胞壁的關鍵因素，α-Man水解 α-1，2、α-1，3和 α-1，6糖苷鍵［10，19]，促使 N-糖蛋白水解產生游離 N-glycans和缺乏寡糖部分的蛋白質，從而破壞細胞壁完整性，導致果實軟化［8]。Meli等［10]研究表明α-Man在番茄果實成熟的破色期和粉紅期階段具有最大活性，而在植物的其他部分（例如莖、葉和根）中均未檢測到α-Man活性。此外，番茄α-Man的RNAi植株果實硬度增加、貨架期延長，并且與細胞壁降解和成熟相關基因的表達均下調。由此可見，通過抑制α-Man酶活性來降低番茄果實成熟軟化是可行的。本研究利用CRISPR-Cas9系統靶向修飾加工番茄α-Man，在sgRNA的指導下，Cas9切割一條雙鏈DNA鏈，產生平末端DNA雙鏈斷裂（DSB），再通過非同源末端連接（NHEJ）在DNA斷裂位點處引入堿基置換、插入或缺失等突變［20]。目前，該技術已成功應用于多種植物體的瞬時或穩定表達，實例包括使用CRISPR/Cas9編輯系統產生的抗白粉病的小麥、耐受性的玉米、不完全成熟的番茄果實以及耐除草劑大豆等［21-24]。

試驗由SlU6驅動sgRNA表達框，35S啟動子驅動hCas9表達框，構建植物表達載體，在加工番茄中建立CRISPR/CAS9基因編輯體系。U6啟動子是CRISPR/Cas9基因組編輯系統的重要元件之一，不同物種U6啟動子驅動單個或多個sgRNA已經成功應用于CRISPR-Cas9系統中，但適用于番茄的U6啟動子研究鮮有報道［25-27]。目前基于棉花 U6 啟動子的CRISPR/Cas9基因編輯載體系統已在海島棉中實現基因定點編輯［28]，因此，本研究選擇番茄U6啟動子驅動sgRNA表達，結合hCas9蛋白編輯α-Man，成功在轉基因加工番茄中檢測到靶序列突變。TA克隆測序結果顯示有2種編輯類型，一種表現為52 bp的缺失突變，對應的氨基酸序列改變，導致蛋白質翻譯結果改變；另一種表現為單堿基突變，且突變位點多樣，說明編輯效果不一致，效率較低，編輯類型較少，這與棉花原生質體和大豆根尖的基因編輯結果類似，Chen等［29-30]瞬時轉化棉花原生質體后檢測突變結果多為單堿基突變，而遺傳轉化檢測結果顯示除了單堿基突變外，還有多堿基缺失突變。出現這種結果的原因可能是因為供以Cas9蛋白切割反應的時間較短，或者由于設計的檢測酶切位點ScaⅠ與PAM距離較遠（5 bp）導致更多的突變沒有被檢測到，除此之外，也可能是檢測樣本量少所致。

Ito等［22]編輯調節番茄果實成熟的MADs盒轉錄因子RIN基因，結果在T0再生植株中Cas9切割位點處檢測到單堿基插入和超過3 bp的缺失突變，并且試驗設計的3個靶點均發生編輯，而本研究中并未發現有堿基插入現象。綜上所述，本研究對加工番茄α-Man的編輯效率低也可能與設計的sgRNA所含GC含量較低或個數較少有關。由于單個gRNA誘導的DSB可能被準確修復，導致編輯效率降低，因此，試驗后期選擇金門克?。℅olden gate cloning）這一快速、簡便、全面的模塊化載體構建系統［31]，以pDIRECT-23C為載體骨架，構建雙靶點敲除載體pDIRECT-Man。載體設計串聯了2個gRNA誘導Cas9蛋白進行切割，來達到實現加工番茄α-Man的多重編輯，提高編輯效率的目的。除此之外，對于載體pDIRECT-Man的轉基因植株，可以直接通過PCR的方式檢測靶向缺失，使得α-Man突變體的篩選更加容易。目前，本研究部分處于加工番茄遺傳轉化階段，后期轉基因植株的獲得和α-Man突變體的鑒定還有待進一步驗證。

4 結論

成功在加工番茄中建立CRISPR/Cas9基因編輯體系，并實現對糖苷水解酶基因α-Man的編輯。