豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)人板層角膜移植術(shù)后植片上皮化的臨床觀察

段虎成，陳瑞，羅嘉婧

(佛山市第二人民醫(yī)院眼科，廣東 佛山 528000)

角膜病是主要致盲眼病之一，感染性角膜炎在發(fā)展中國家的發(fā)病率和致盲率很高，每年由角膜感染引起的單眼盲患者約150萬例。感染性角膜炎在藥物治療無效的情況下及時(shí)行角膜移植術(shù)是治療的重要措施，由于國內(nèi)角膜供體材料缺乏使多數(shù)患者失去治療時(shí)機(jī)[1-2]。近年來研究[3-4]顯示：豬來源的角膜在經(jīng)過脫細(xì)胞和去抗原處理后可降低其免疫原性，并可保留角膜三維立體結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性并已制備成商品化的生物角膜材料。其應(yīng)用于人板層角膜移植術(shù)后植片的長期存活及恢復(fù)過程受到臨床眼科醫(yī)師的關(guān)注[5]。術(shù)后角膜上皮化情況直接影響到角膜植片的存活、修復(fù)及透明度，順利的角膜上皮化過程可以減少新生血管長入，免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生及植片溶解。本研究應(yīng)用豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)行角膜板層移植，術(shù)后重點(diǎn)觀察角膜上皮化過程，評(píng)價(jià)脫細(xì)胞生物角膜作為異種材料進(jìn)行人眼板層角膜移植的有效性及安全性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

收集2017年1月至2018年1月在佛山市第二人民醫(yī)院診斷為單眼感染性角膜炎行脫細(xì)胞角膜基質(zhì)板層角膜移植的患者5例，年齡56～86歲。采用脫細(xì)胞角膜基質(zhì)(商品名：艾欣瞳)行板層移植術(shù)，以對(duì)側(cè)眼為對(duì)照觀察角膜上皮化修復(fù)過程。入組標(biāo)準(zhǔn)：確診為感染性角膜炎，前期經(jīng)過規(guī)范的藥物治療病情無明顯好轉(zhuǎn)，需要手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)檢查病灶累及全層，對(duì)側(cè)眼有角膜炎、干眼、青光眼及屈光不正等眼部疾病。本研究經(jīng)佛山市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者入組前簽署手術(shù)知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 生物角膜材料來源

生物角膜是由深圳艾尼爾角膜工程有限公司提供的豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)(商品名：艾欣瞳)。

1.2.2 手術(shù)步驟

手術(shù)均由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師完成。術(shù)眼用2%布比卡因和0.75%利多卡因1:1混合劑行球后麻醉，置開瞼器，固定上、下直肌，充分沖洗結(jié)膜囊，根據(jù)病灶直徑選擇合適的角膜環(huán)鉆制作角膜植床，范圍超過病灶區(qū)0.25～0.5 mm。板層剖切病變角膜，至病灶完全清除，選擇大于病灶角膜直徑0.5 mm的環(huán)鉆制作脫細(xì)胞角膜植片，厚度400 μm，采用10.0尼龍線將植片間斷對(duì)位縫合于角膜植床，線結(jié)埋藏。術(shù)后依據(jù)病情應(yīng)用0.5%左氧氟沙星滴眼液、更昔洛韋滴眼液、那他霉素滴眼液或妥布霉素地塞米松滴眼液聯(lián)合他克莫司滴眼液點(diǎn)眼，4次/d。

1.2.3 主要療效指標(biāo)

分別于術(shù)后3 d，7 d，1個(gè)月，3個(gè)月，6個(gè)月對(duì)患者進(jìn)行隨訪，在裂隙燈顯微鏡下觀察移植后植片上皮化程度、植片透明情況及免疫排斥反應(yīng)。術(shù)后1，3及6個(gè)月采用共聚焦顯微鏡檢查角膜上皮細(xì)胞形態(tài)及密度，利用內(nèi)置NAVIS軟件對(duì)細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行綜合分析，與對(duì)側(cè)眼角膜上皮細(xì)胞密度比較，觀察角膜上皮化過程及上皮下神經(jīng)纖維生長情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。術(shù)后角膜上皮細(xì)胞密度數(shù)據(jù)資料經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，手術(shù)前后不同時(shí)間點(diǎn)角膜上皮細(xì)胞密度采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后植片上皮化過程

裂隙燈顯微鏡下可見：術(shù)后1～3 d角膜水腫明顯，植片混濁，角膜緣血管充血，術(shù)后3 d在植片邊緣線結(jié)處觀察角膜上皮生長。至術(shù)后10 d角膜水腫基本消退，角膜上皮細(xì)胞跨過植片邊緣，向中心生長，逐步完成角膜上皮化，但是熒光素染色仍能觀察到點(diǎn)狀染色。術(shù)后1個(gè)月植片透明度逐漸恢復(fù)，角膜上皮化良好。病毒性角膜炎患者上皮化時(shí)間延長，1例患者術(shù)后20 d才完成角膜上皮化，植片透明度明顯低于其他病例。術(shù)后6個(gè)月植片逐漸恢復(fù)透明，無感染復(fù)發(fā)現(xiàn)象(圖1)。

圖1 病例1術(shù)前、術(shù)后裂隙燈顯微鏡檢查Figure 1 Preoperative and postoperative slit-lamp microscope examination of case 1

2.2 激光掃描共聚焦顯微鏡下角膜形態(tài)學(xué)檢查

術(shù)后1，3，6個(gè)月激光掃描共聚焦顯微鏡下可見術(shù)眼角膜植片上皮基底細(xì)胞排列規(guī)則、緊密，呈多邊形，細(xì)胞邊界清晰，復(fù)層結(jié)構(gòu)。上皮細(xì)胞密度與對(duì)側(cè)健眼接近，總體差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。術(shù)后6個(gè)月可見植片上皮下有稀疏、彎曲的神經(jīng)纖維長入。

表1 術(shù)眼術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)與對(duì)側(cè)眼角膜上皮細(xì)胞密度值的比較Table 1 Comparison of corneal epithelial cell density between the operated eyes and the contralateral eyes at different postoperative time points

表1 術(shù)眼術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)與對(duì)側(cè)眼角膜上皮細(xì)胞密度值的比較Table 1 Comparison of corneal epithelial cell density between the operated eyes and the contralateral eyes at different postoperative time points

組別 上皮細(xì)胞密度/mm對(duì)側(cè)眼 6 129±169 1個(gè)月 5 873±145 3個(gè)月 5 980±165 6個(gè)月 5 988±178

2.3 隨訪結(jié)果

入組5例患者均應(yīng)用他克莫司滴眼液預(yù)防免疫排斥反應(yīng)。術(shù)后6個(gè)月，植片無水腫，無免疫排斥反應(yīng)發(fā)生。1例患者植片邊緣縫線處有新生血管長入，予以拆除局部縫線。1例在術(shù)后8個(gè)月自行停用他克莫司眼液后發(fā)生排斥反應(yīng)，早期表現(xiàn)為植片水腫，縫線處新生血管長入，后期出現(xiàn)角膜植片邊緣混濁溶解，予以局部及全身應(yīng)用激素，增加他克莫司滴眼頻率，排斥反應(yīng)控制，新生血管長入植片邊緣。

3 討論

豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)作為擁有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)并上市的生物角膜材料，其臨床應(yīng)用還處于早期研究階段，應(yīng)用于人板層角膜移植手術(shù)的臨床大樣本研究的相關(guān)報(bào)道[5-6]并不多。在角膜移植術(shù)后，角膜迅速上皮化有利于角膜移植片水腫吸收和炎癥反應(yīng)消退，同時(shí)減少角膜新生血管長入，減少角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生。角膜植片上皮長期缺損將導(dǎo)致角膜植片水腫、混濁，甚至直接溶解。我們觀察到：脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上皮化時(shí)間與人角膜移植術(shù)后上皮化時(shí)間基本一致，3 d左右明顯觀察到角膜上皮跨過植片邊緣生長，術(shù)后7～10 d完成角膜上皮化，其早期愈合過程與人角膜板層角膜移植恢復(fù)過程基本一致，表明移植的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)完全適合角膜上皮的移行和生長。角膜上皮化與患者原發(fā)病、植片與植床對(duì)合情況、縫線等多因素有關(guān)。入組病例中病毒性角膜炎患者角膜上皮愈合延遲，1例患者術(shù)后20 d角膜上皮才最終愈合，植片透明度恢復(fù)差。分析原因可能與病毒性角膜炎患者神經(jīng)營養(yǎng)不良及本身淚液分泌情況異常等因素有關(guān)[7-8]，也提示臨床醫(yī)師在開展上述手術(shù)過程中應(yīng)慎重選擇合適的患者作為手術(shù)治療對(duì)象。

術(shù)后1，3，6個(gè)月激光掃描共聚焦顯微鏡下可見術(shù)眼角膜植片上皮基底細(xì)胞排列規(guī)則、緊密，呈多邊形，細(xì)胞邊界清晰，復(fù)層結(jié)構(gòu)。上皮細(xì)胞密度與對(duì)側(cè)健眼接近，總體差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。王素娟等[8-9]報(bào)道：應(yīng)用脫細(xì)胞角膜基質(zhì)對(duì)15例角膜炎患者行板層角膜移植，術(shù)后應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察角膜上皮修復(fù)情況與本研究結(jié)果相近，提示一旦角膜植片完成上皮化過程，經(jīng)過一段時(shí)間的上皮細(xì)胞更替，細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，也表明豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)能夠與角膜上皮細(xì)胞形成緊密結(jié)合，上皮細(xì)胞黏附穩(wěn)定。良好穩(wěn)定的角膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)也利于移植片逐漸恢復(fù)透明。

術(shù)后6個(gè)月觀察期內(nèi)，在應(yīng)用免疫抑制劑的條件下患者未出現(xiàn)植片免疫排斥反應(yīng)。生物工程角膜材料的免疫原性在臨床應(yīng)用中是否會(huì)出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)及出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)后藥物是否可以控制一直是眼科臨床醫(yī)師關(guān)注的焦點(diǎn)問題。后期隨訪發(fā)現(xiàn)：1例患者在術(shù)后8個(gè)月自行停止應(yīng)用他克莫司滴眼液后出現(xiàn)了局部角膜水腫，縫線處新生血管長入，隨后出現(xiàn)角膜植片局部混濁及溶解。予以口服激素，局部增加激素滴眼液用量和他克莫司滴眼液用量，聯(lián)合使用人工淚液后，患者的免疫排斥反應(yīng)控制，但是局部角膜植片變薄，新生血管長入。因此，術(shù)后植片免疫排斥反應(yīng)仍舊是影響植片存活的主要問題，合理應(yīng)用免疫抑制劑可以預(yù)防局部免疫反應(yīng)的發(fā)生。

在同種異體角膜供體匱乏的情況下，應(yīng)用豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)板層角膜移植治療感染性角膜炎后，移植片能夠迅速完成角膜上皮化過程，達(dá)到控制感染，保存眼球的臨床目的。但本研究觀察的樣本量較少，觀察時(shí)間較短，其遠(yuǎn)期效果及安全性評(píng)價(jià)還需更大樣本量的長期隨訪觀察。