Box-Behnken結合響應面法優化制備氟尿嘧啶長循環熱敏脂質體

吳義來，汪魏平，徐文科

氟尿嘧啶（Fluorouracil，FU）作為經典的抗腫瘤藥，其抗瘤譜廣，對消化道腫瘤、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、絨毛膜上皮癌和皮膚癌等均有一定療效.臨床上，FU單獨使用或與其他藥物聯合應用于乳腺癌和胃腸道腫瘤手術后的輔助治療［1］.但是，FU脂溶性小，口服吸收不規則，生物利用度低，故一般采用靜脈給藥.持續輸液可較長時間在機體中維持有效血藥濃度，臨床效果優于靜脈推注，但較長時間的輸液降低了患者的依從性和順應性.另外，FU嚴重的骨髓抑制和消化道毒性等強烈的毒副作用發生率較高，這些缺點都極大限制了其臨床應用［2-3］.

脂質體是一種由磷脂或其他輔助成分分散于水相中有序排列形成的單層或多層囊泡，其磷脂雙分子層結構類似生物膜，故相容性較好［4］.本研究擬采用經典的熱敏長循環處方：二棕櫚酰基卵磷脂（Dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC）、單鏈溶血磷脂（Mono-stearoyl phosphatidylcholine，MSPC）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙 二 醇 2000（Distearoyl phosphoethanolamine-PEG2000，DSPE-PEG2000）制備氟尿嘧啶長循環熱敏脂質體（Fluorouracil loaded Long-circulating thermo-sensitive liposomes，FU-LCTSLs），利 用Box-Behnken結合響應面法優化各成分比例，制備包封率較高、穩定性較好的FU-LCTSLs，為后續的藥效學實驗奠定基礎.

1 材料

1.1 藥品與試劑

FU（美國Sigma公司，純度＞99%）；DPPC（日本NFC公司，純度99.5%）；MSPC（日本NFC公司，純度97.2%）；DSPE-PEG2000（日本NFC公司，純度99.86%）；NaCl（天津德恩化工試劑有限公司）；KCl（天津博迪化工股份有限公司）；Na2HPO4·12H2O（天津天力化工試劑有限公司）；KH2PO4（天津化工試劑三廠）；濃鹽酸（武漢中天化工有限責任公司）；甲醇（色譜純，德國默克）；無水乙醇（分析純，天津德恩試劑有限公司）；超純水（實驗室自制）.

1.2 儀器與耗材

高效液相色譜系統（含Waters 2707自動進樣器、Waters 1525二元泵、Waters 2998二極管陣列檢測器及BreezeTM2操作系統，美國Waters公司）；微型脂質體擠出器（Avestin，加拿大）；高速離心機（ThermoFisher，美國）；分析天平（FA1004型電子天平，上海天平儀器廠）；精密天平（AUW220D型電子天平，日本島津公司）；超聲清洗儀（SK-8200HP型，上海科導超聲儀器有限公司；真空泵（SHB-Ⅲ循環水式泵，鄭州長城有限公司）；純水制備儀（優普超純水機，成都超純科技有限公司）；精密pH計（pHS-3B型，上海精科雷磁科學儀器有限公司）；普通冰箱（BCD-216T XZ型冰箱，青島海爾有限公司）.

2 方法與結果

2.1 FU-LCTSLs制備

按處方量分別稱取DPPC、MSPC及DSPEPEG2000（DPPC∶ MSPC∶ DSPE- PEG2000=86∶10∶4，摩爾比），溶于氯仿/乙醚混合液（1∶2，V/V），置于500 mL茄形瓶中.將FU溶于pH=4.0的檸檬酸緩沖溶液中，緩慢加入茄形瓶中，渦旋3 min混合有機相和水相，水浴超聲至形成均一穩定的W/O型乳狀液（靜置30 s不分層）.55℃減壓旋蒸除去有機溶劑，使乳液在瓶壁上形成凝膠，繼續旋蒸至凝膠脫落，得到均勻的脂質體混懸液.用1 mol/L磷酸氫二鈉溶液將pH調至7.4，以pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液調至適當濃度后，55℃水浴保溫15 min.所得脂質體混懸液25℃水浴超聲10 min后擠壓通過100 nm聚碳酸酯膜，得到粒徑約100 nm的脂質體.

2.2 FU含量測定方法學建立

（1）色譜條件.色譜柱：Thermo Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（35∶65，V/V）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：265 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL.

（2）專屬性試驗.取0.4 mL空白脂質體、FU脂質體分別以0.4 mL甲醇破乳后進樣10 μL，按2.2（1）所述色譜條件分析，記錄色譜圖.FU保留時間在4.5 min左右，峰型良好，空白脂質體以及破乳劑甲醇對FU的含量測定無干擾.

（3）標準曲線的建立.稱取FU對照品12.03mg，以流動相溶解，定容至25 mL，所得標準品溶液濃度為481.20 μg/mL，作為母液，4℃避光保存備用.精密吸取母液，稀釋成濃度為481.20 μg/mL、240.60 μg/mL、60.15 μg/mL、30.08 μg/mL、15.04 μg/mL、7.52 μg/mL系列標準溶液.精密吸取系列標準溶液各進樣10 μL，按2.2（1）所述色譜條件分析，記錄色譜圖和峰面積，以標準溶液濃度c為橫坐標，FU峰面積響應值A為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程A=32740c+14 670，相關系數r=0.9998.結果顯示，在7.52～481.20μg/mL范圍內，峰面積與濃度線性關系良好.

（4）精密度試驗.日內精密度：取制備好的FU脂質體，按樣品處理方法制備6批樣品，連續進樣，記錄峰面積，計算RSD%；日間精密度：取制備好的同一批FU脂質體，按樣品處理方法處理后，連續6天進樣，記錄峰面積，計算RSD%.日內精密度和日間精密度試驗RSD%分別為1.19%、1.10%，說明該檢測方法精密度良好.

（5）回收率試驗.取9支EP管，各加入0.4 mL空白脂質體，分別加低濃度（15.04 μg/mL）、中濃度（240.60 μg/mL）、高濃度（481.20 μg/mL）FU對照品溶液各0.8 mL，每濃度各加三支EP管，加0.4 mL甲醇，渦旋破膜，進樣測定，計算回收率，低、中、高濃度樣品平均加樣回收率分別為97.52%、99.54%和99.13%，符合方法學要求.

（6）包封率測定方法.本實驗采用超濾離心法分離游離藥物.精密吸取0.4 mL已制備的載藥脂質體于超濾管內，將超濾管套入剪去管帽的EP管中，8 000 rpm離心30 min，向超濾管中加0.4 mL的PBS，繼續離心30 min，收集EP管中濾液，進樣分析，測定游離藥物含量；另取0.4 mL載藥脂質體0.4 mL甲醇破乳后，進樣分析，測定藥物總含量，按下式計算包封率.

包封率（EE）%=脂質體包封的藥物量/（脂質體包封藥物量+游離藥物量）×100%.

2.3 處方優化

本實驗利用Design Expert軟件實現Box-Behnken實驗設計法結合響應面法（BBD-RSM），以脂質體的包封率為響應值Y（%），選取對脂質體包封率影響較為顯著的3個因素，分別記作X1（磷脂與FU質量比）、X2（水化液FU濃度），X3（有機相與水相體積比），在-1、0、+1三個水平上進行優化研究，建立多元二次回歸方程數學模型［5-6］.各因素水平見表1，建立的Box-Benhnken實驗設計及結果如表2所示.

表1 Box-Behnken實驗設計的因素和水平

2.3.1 二次回歸方程的建立

對表2中的數據進行多元二次回歸分析，得到X1、X2、X3與Y的二次多項回歸方程

對該模型進行顯著性檢驗，回歸模型方差分析結果見表3.

表2 Box-Behnken設計與試驗結果

表3 包封率回歸模型方差分析

由方差分析結果可知，模型F值=42.20，P＜0.000 1，表明模型極顯著；P＜0.05的模型項顯著，所以本試驗中X1、X2、X3、X1X3、、對Y的影響極顯著，其他項對Y的影響不顯著.故上述多元二次回歸模型可優化為

模型的概率P＜0.000 1，表明模型極顯著；同時，方程的失擬項F值為2.75，概率P＞0.05，失擬項不顯著，說明該回歸方程在整個回歸區域的擬合情況良好，可以用該模型準確模擬X1（磷脂與FU質量比）、X2（水化液FU濃度），X3（有機相與水相體積比）對Y（包封率%）的影響［7］.

2.3.2 效應面優化和預測

利用Design-Expert軟件分別固定X1（磷脂與FU質量比）、X2（水化液FU濃度），X3（有機相與水相體積比）三個影響因素其中之一，分析其他兩個因素對響應值Y（包封率%）的影響，繪制得到不同影響因素對于響應值的三維曲線圖和二維等高線，見圖1.

根據BBD-RSM試驗結果，得到優化條件為：脂質體膜材與氟尿嘧啶的質量比為9.2∶1，水化液中氟尿嘧啶的濃度為10 mg·mL-1，有機相與水相的體積比為7∶1.

圖1 各因素對包封率Y的3D響應面圖和等高線圖

表4 驗證及重現性實驗結果

根據上述優化條件，制備3批最優處方樣品并分別測定包封率，以檢驗BBD-RSM試驗所得結果的可靠性.按BBD-RSM試驗所得最優處方包封率的理論值為41.26%，而3批樣品實測包封率的平均值為40.85%，RSD為1.93%，說明此模型可靠，預測準確.

由以上結果可以看出，該處方工藝重現性良好，制備的脂質體粒徑符合要求，包封率穩定，適用于制備FU-LCTSLs.

2.4 理化性質研究

對經優化后的FU-LCTSLs理化性質進行考察，主要包括粒徑分布、Zeta電位、pH值以及熱敏特性考察.

2.4.1 粒徑分布和Zeta電位

取制備好的FU-LCTSLs于EP管中，PBS稀釋10倍，混合均勻后加入比色皿，檢測FU-LCTSLs樣品的粒徑和Zeta電位.每個樣品平行測定3次.

同一份樣品平行測定所得粒徑結果精密度良好，平均粒徑113.7±8.7 nm，PDI=0.538±0.072.粒徑結果表明，FU-LCTSLs粒徑大部分分布在110 nm左右，且粒徑較規整均一.平均Zeta電位為-15.34±4.26 mV.

2.4.2 pH值

磷脂通常在中性條件下較穩定，為了保證脂質體在儲存過程中的穩定性，減少磷脂的水解，脂質體制備過程最后將其pH調節到7.4，并且以pH=7.4的PBS緩沖液稀釋，維持較穩定的中性pH環境.制備好的FU-LCTSLs溶液以pH計測得的pH值為7.35±0.04（n=3）.符合脂質體保存的pH條件要求.

2.4.3 熱敏性評價

熱敏性好壞是評價熱敏脂質體制備成功與否的關鍵因素之一.成功的熱敏脂質體在正常體溫單位內保持不釋藥，當到達正接收熱療的腫瘤靶部位，熱療溫度使熱敏脂質體膜從緊密有序的膠晶態轉變為紊亂松散的液晶態，脂質體內部包載的抗腫瘤藥物大量釋放，從而迅速達到治療濃度.

本研究中，我們以水浴法結合超濾離心法分別考察FU-LCTSLs在正常體溫37℃至熱療溫度42℃間不同溫度環境下的釋藥行為，用以評價制備得到的FU-LCTSLs熱敏性.

（1）溫度依賴的熱敏釋放行為.取6支玻璃試管，分別加入等量適量的14102001批次脂質體，6支試管做標記后分別放入37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃水浴鍋中，加熱8 min后立即取出試管，冰浴冷卻，超濾離心法測定游離藥物濃度，計算釋藥率.結果如圖2.

圖2 不同溫度下FU-LCTSLs釋藥率直方圖

由圖2可知，FU-LCTSLs對溫度變化較為敏感，當水浴溫度低于40℃時，8 min釋藥率不超過20%，而當溫度達40℃時釋藥開始加快，42℃時8 min釋藥率達96.49%，包封FU近乎完全釋放.FU-LCTSLs表現出良好的溫度敏感性.

（2）時間依賴的熱敏釋放行為.取2支玻璃試管，分別加入等量適量的14102001批次脂質體，pH=7.4的PBS稀釋4倍，試管做好標記后分別放入37℃、42℃水浴鍋中溫育，分別在1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、8 min、15 min、30 min取0.4 mL脂質體懸浮液置EP管中（同時用0.4 mL等溫的PBS補液），冰浴冷卻，超濾離心法測定游離藥物濃度，計算釋藥率，繪制時間-釋藥率曲線，結果如圖3.

圖3 FU-LCTSLs在37℃和42℃水浴條件中的釋藥曲線

由圖3可知，37℃水浴30 min FU釋藥率僅4.32%，而在42℃水浴條件下，8 min時藥物幾乎全部釋放.采用Origin對FU-LCTSLs在42℃下的釋放曲線進行擬合，結果見表5.

表5 42℃FU-LCTSLs釋放曲線動力學擬合結果

體外釋放模型相關性從高到低依次為：一級＞Higuchi＞零級，說明FU-LCTSLs在42 ℃條件下的釋放最優擬合為一級釋放模型.

2.5 穩定性考察

2.5.1 過濾穩定性

動物試驗所用脂質體必須無菌無熱原，通常脂質體產品要求在無菌環境下制備，結束后需要進行過濾除菌.過濾除菌法又稱微孔過濾法，微孔濾膜的孔徑為0.22 μm，可有效濾除制劑中大小為0.3 μm以上的大部分細菌，適用于工業生產中的脂質體除菌.過濾穩定性試驗對過濾前后脂質體的漏藥率進行評價，從而評估過濾除菌的可行性.

取兩支一次性注射器針筒，在超凈工作臺中將其套上已滅菌的0.22 μm濾頭，分別取14102001批FU-LCTSLs溶液和5倍稀釋液于注射器中，輕推注射器過濾，將濾液注入已滅菌的西林瓶中，取過濾后的脂質體溶液測定漏藥率，結果如表6.

其中，W前為脂質體過濾前包封的藥物濃度；W后為脂質體經過濾除菌后包封的藥物濃度.

表6 過濾穩定性結果

由試驗結果可知，FU-LCTSLs溶液原液過濾后包封率有所下降，而稀釋液包封率基本不變.可能是因為原液中脂質體濃度較高，通過濾孔時發生相互擠壓的機率和頻率較大，脂質體本身產生一定程度的破碎，繼而融合，使得藥物略有滲漏.稀釋液中脂質體濃度相對較低，通過濾孔時發生擠壓的頻率次數較少，所以包封率基本沒有發生變化，過濾穩定性良好.

2.5.2 稀釋穩定性

取FU-LCTSLs加入至兩個西林瓶中，分別加入5%葡萄糖溶液和注射用水稀釋20倍，室溫放置6 h，測定漏藥率，平行測定三次，結果如表7.

表7 稀釋穩定性結果（%）

由試驗結果可知，以5%葡萄糖溶液和注射用水稀釋FU-LCTSLs，包封率均未發生顯著變化，說明FU-LCTSLs的稀釋穩定性較好.

2.5.3 貯藏穩定性

取FU-LCTSLs于西林瓶中，分別置于4℃冰箱和25℃室溫避光保存，于第5天和第10天取出，檢測脂質體漏藥率，結果見表8.

表8 不同溫度穩定性結果

由試驗結果可知，FU-LCTSLs室溫避光放置漏藥率較高，而4℃避光冷藏則相對穩定，因而將FU-LCTSLs貯藏方式確定為4℃避光冷藏.

2.5.4 放樣穩定性

取FU-LCTSLs于西林瓶中，放入4℃冰箱內，于0月、1月、2月、3月和6月取樣檢測脂質體漏藥率，結果見表9.

表9 FU-LCTSLs 4℃放樣6個月漏藥率結果

由試驗結果可知，FU-LCTSLs在4℃貯藏條件下保存6個月漏藥率仍保持在較低水平，理化性質基本保持穩定.

3 討論

本實驗中，確定FU-LCTSLs采用文獻中經典熱敏長循環處方：DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000=86∶10∶4（摩爾比）.DPPC相變溫度41℃，在人體能夠耐受的局部加熱溫度范圍內是最常用的熱敏脂質體膜材.處方中加入少量水溶性單鏈磷脂MSPC，在溫度達DPPC相變溫度時，MSPC可尾部相互聚集，頭部在脂質體表面形成釋藥小孔，加速藥物從內部釋放到腫瘤熱療部位.另外，DSPE-PEG2000摻入脂質體后，親水PEG2000鏈在脂質體表面形成致密的構象云，避免脂質體迅速被MPS識別并吞噬，從而顯著延長脂質體在體內循環中的滯留時間，利用EPR效應，這些長循環脂質體會相對多地靶向到腫瘤部位.

制備脂質體時，主動載藥法制備的脂質體包封率較大，性質較穩定，不易發生藥物的泄漏，本文將主動載藥法與被動載藥法相結合，即pH梯度法結合逆相蒸發法，制備大單室脂質體，有利于親水性藥物FU的包封，而pH梯度法極大地提高了包封率.經優化后的FU-LCTSLs外觀半透明而帶藍色乳光，平均粒徑113.7±8.7 nm，PDI=0.538±0.072，表明FU-LCTSLs粒徑大部分分布在110 nm左右，且粒徑較規整均一；平均Zeta電位-15.34±4.26 mV，在膠態體系中能較長時間保持穩定，不聚集.脂質體溶液的pH值為7.35±0.04（n=3），符合脂質體儲存的pH要求.FULCTSLs對溫度變化較為敏感，當水浴溫度低于40℃時，8 min釋藥率不超過20%，而當溫度達40℃時釋藥開始加快，42℃時8 min釋藥率達96.49%，包封FU近乎完全釋放.FU-LCTSLs表現出良好的溫度敏感性提示FU-LCTSLs在正常血液循環內會保持不釋藥，當利用EPR富集到正接收熱療的腫瘤靶部位時，脂質體內部包載的抗腫瘤藥物會大量釋放，迅速達到治療濃度，從而實現增效減毒的作用.

Box-Behnken設計具有預測性好、結果直觀、操作簡單的特點，能以最少的實驗次數更快更高效地優化工藝參數，目前在藥物處方篩選方面已得到非常廣泛的應用［8-9］.本試驗運用Box-Behnken結合響應曲面法優選脂質體制備處方，極大地減少了工作量，成功地構建X1（磷脂與FU質量比）、X2（水化液FU濃度），X3（有機相與水相體積比）對包封率影響的模型，并直觀地預測了最優處方.按所得優化條件制備3批樣品分別測定其包封率，進行驗證實驗，模型預測最優處方脂質體包封率理論值為41.26%，實測包封率的平均值為40.85%，偏差為0.41%，說明此模型的預測準確可靠.處方工藝重現性良好，制備的脂質體粒徑符合要求，包封率穩定，適合用于制備FU-LCTSLs.

穩定性試驗包括對過濾穩定性、稀釋穩定性、貯藏穩定性和長期放樣穩定性等的考察，結果顯示，FU-LCTSLs可成功通過過濾滅菌而不發生較多FU泄漏，與5%葡萄糖注射液和滅菌注射用水混合稀釋至20倍滲漏率在可接受范圍.貯藏穩定性實驗提示，FU-LCTSLs的短期貯藏應保持在4℃冷藏室中.長期放樣實驗顯示，FU-LCTSLs混懸液滲漏率隨時間延長而加快，如想長期放置仍需考察凍干后保存的滲漏率變化.