乳酸菌發酵飼料對SPF 雞免疫功能的影響

李 錦，朱風華，陳 甫，朱連勤

（青島農業大學動物醫學院，山東青島 266109）

乳酸菌是應用最早、最廣泛的益生菌，是一類可利用碳水化合物發酵產生大量乳酸的細菌總稱。乳酸菌具有益生菌的效用，如維持動物胃腸道菌群平衡、提高機體免疫水平、促進動物生長和改善腸道環境，具有良好應用價值。Missotten 等[1]用植物乳桿菌飼喂1 日齡肉雞，飼料利用率明顯提高。付麗[2]將添加乳酸菌的飼料飼喂艾拔益加（AA）肉仔雞，肉雞免疫器官指數、血清雞新城疫抗體（NDV-Ab）效價、血清IgA 含量均有顯著提高。張曉羊等[3]報道，與飼喂6%棉粕的基礎飼料相比，飼喂含6%嗜酸乳桿菌發酵棉粕的試驗飼料蛋雞組的脾臟指數、法氏囊指數和血白細胞介素-2（IL-2）含量均顯著提高，脾臟中白細胞介素-10（IL-10）mRNA表達量極顯著提高。孫偉[4]研究發現，用乳酸菌發酵飼料置換蛋雞配合飼料可提高血清禽流感病毒H9 亞型（AIV H9N1）和NDV-Ab 水平。大部分研究表明乳酸菌可以增強家禽免疫功能，但乳酸菌發酵飼料是否是通過作用SPF 雛雞信號通路來提高雛雞免疫功能，尚少見報道。因此，本研究以SPF 雛雞為試驗對象，通過研究乳酸菌發酵飼料和PI3K 阻斷劑對其體液免疫、細胞免疫功能以及脾臟組織中PI3K、Akt mRNA 基因表達量和PI3K、Akt 蛋白表達量的影響，探討乳酸菌發酵飼料提高SPF 雞免疫功能與SPF 雞PI3K/Akt 信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 選取14 日齡SPF 雛雞120 羽，隨機分為4 組，每組5 個重復，每個重復6 羽。對照組飼喂基礎飼料，發酵飼料組飼喂乳酸菌發酵飼料，基礎阻斷劑組為基礎飼料+PI3K 阻斷劑，乳酸菌阻斷劑組為發酵飼料+PI3K 阻斷劑。基礎阻斷劑組、乳酸菌阻斷劑組受試雞每天每羽灌服1 mL 阻斷劑LY294002（含阻斷劑0.7 mg），連續灌服21 d。對照組、發酵飼料組于相同時間灌服相同劑量的生理鹽水。試驗期21 d。雛雞自由飲食，按正常免疫程序進行免疫接種。

1.2 基礎飼料與發酵飼料 乳酸菌發酵飼料制作參照王赫等[5]方法。基礎飼料和發酵飼料組成及營養成分見表1。

表1 基礎飼料和發酵飼料組成及營養成分（風干基礎）

1.3 試驗材料 LY294002（HY-10108）購自Med Chem Express（Monmouth Junction，NJ，USA)；植物乳桿菌（20765）、嗜酸乳桿菌（6006）均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心；Akt 抗體（ab106693）購自Abcam中國；PI3K 抗體（bs-2067R）購自北京博奧森生物技術有限公司；磷酸化Akt（Phospho-Akt）（Ser473）抗體（AA329）、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG（A0216）、HRP 標記山羊抗小鼠IgG（A0208）均購自碧云天生物技術；MMT 試劑盒購自美國 Sigma 公司；NDV-Ab、IgA、IgM、IgG、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6 ELISA 試劑盒購自上海潤裕生物科技有限公司。

1.4 主要儀器設備 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；MK3 型酶聯免疫酶標儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；低溫超速離心機（上海安亭科學儀器廠）；Gel Doc 1000 凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad 公司）；PCR擴增儀（美國ABI 公司）；Step One plus 型熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；紫外可見分光光度計（日本Bio Spes-nano 公司）；Tanon 4200 全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 生長性能 于試驗第1 天和21 天稱體重、稱飼料，以重復為單位計算雛雞試驗期間的平均日增重（ADG）、耗料增重比（F/G）和平均日采食量（ADFI）。

1.5.2 外周血淋巴細胞轉化率 于試驗第21 天從各組每個重復中各隨機取1 羽雞，進行無菌翅靜脈采集抗凝血，刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）刺激淋巴細胞增殖，方法及條件優化參照馮焱等[6]，于570 nm處測定OD 值，測得T、B 淋巴細胞轉化率。

1.5.3 抗體與細胞因子 于試驗第21 天各組每個重復中各隨機取1 羽雞，心臟無菌采集血液，4℃靜置1 h，3 000 r/min 離心15 min，分離血清，-20℃保存。用酶聯免疫吸附法測定雛雞血清中NDV-Ab、IgA、IgM、IgG、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6 含量。

1.5.4 PI3K、Akt mRNA 表達量的測定 取15～20 mg脾臟，用碧云天生物技術RNAeasyTM動物RNA 抽提試劑盒（離心柱式）提取組織總RNA。紫外可見分光光度計測定總RNA 濃度及純度，所有樣品OD 比值（OD260nm/OD280nm)在1.8～2.0，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 完整性，-80℃保存。

使用碧云天生物技術BeyoRTTMⅡcDNA 合成試劑盒（with gDNA Eraser）逆轉錄試劑盒將總RNA 逆轉錄為cDNA，所得cDNA 于-20℃保存或直接用于實時熒光定量PCR 檢測。

實時熒光定量PCR 檢測目的基因表達情況，使用碧云天生物技術BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix（2X）試劑盒檢測PI3K、Akt mRNA 的表達量，并用實時熒光定量PCR 儀測定。根據GenBank 上公布的雞PI3K、Akt 基因的保守核苷酸序列，用Primer 設計并合成3 對特異性引物（表2），以cDNA 為模板進行PCR 反應，以β-肌動蛋白（β-actin）表達量為參比，用2-△△CT法計算目的基因相對表達量。

表2 引物序列

1.5.5 PI3K、Akt 蛋白表達量

1.5.5.1 組織處理把脾臟組織剪成細小的碎片，融解RIPA 裂解液，混勻，取適量裂解液，在使用前數分鐘內加入1 mmol/LPMSF，1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑制成混合液后置冰上，按RIPA 裂解液說明書處理，用玻璃勻漿器勻漿，提取總蛋白，取適量樣品采用BCA 試劑盒測樣品總蛋白濃度，剩余樣品冷凍備用。

1.5.5.2 蛋白質免疫印跡檢測 分別向每種樣品添加SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5X），95℃加熱10 min使蛋白質變性，調整上樣量為30 μg 進行電泳，濃縮膠（80 V，20 min），分離膠（120 V，40 min）。將PVDF 膜在浸活液中浸活1 min，蛋白質經電泳分離后，轉移到PVDF 膜上（200 mA，4℃轉膜60 min），轉移后，取出PVDF 膜，用Tris-Hcl 緩沖液（TBST）漂洗3 次，每次5 min。封閉液封閉10 min，取出PVDF膜后用TBST 漂洗3 次，每次5 min。將其與1X 磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋的1 000 倍的1 抗結合，在搖床上4℃過夜孵育，取出PVDF 膜后用TBST 漂洗3 次，每次5 min。后與1X PBS 稀釋3 000 倍的第2 抗體結合，在搖床上孵育2 h，再次用TBST 漂洗3 次，每次5 min。用超敏ECL 化學發光試劑盒顯色，2 min 后置于熒光成像儀檢測（Tanon 4 200）。用天能GIS 1D 分析軟件分析。

1.6 統計分析 試驗數據采用SPSS 22 軟件單因素方差（One-Way ANOVA）程序進行單因素方差分析，差異顯著性采用Duncan's 法進行多重比較，P＜0.05 時表示差異性顯著，P＜0.01 表示差異性極顯著，結果均以平均值±標準差表示。

2 結 果

2.1 乳酸菌發酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞生長性能的影響 如表3 所示，ADG 和F/G 在4 組間均差異顯著，ADG 為發酵飼料組＞對照組＞乳酸菌阻斷劑組＞基礎阻斷劑組（P＜0.05），F/G 為發酵飼料組＜對照組＜乳酸菌阻斷劑組＜基礎阻斷劑組（P＜0.05）。

表3 乳酸菌發酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞生長性能的影響

2.2 乳酸菌發酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞外周血淋巴細胞的影響 如表4 所示，發酵飼料組T、B 淋巴細胞轉化率顯著高于其余各組，對照組T、B 淋巴細胞轉化率顯著高于乳酸菌阻斷劑組，乳酸菌阻斷劑組T、B 淋巴細胞轉化率顯著高于基礎阻斷劑組。

表4 乳酸菌發酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞外周血淋巴細胞轉化率的影響 %

2.3 乳酸菌發酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞血清細胞因子含量的影響 如表5 所示，IL-2、IL-6、IFN-α 水平在4 組間均為發酵飼料組＞對照組＞乳酸菌阻斷劑組＞基礎阻斷劑組（P＜0.05）。各組其他指標無顯著差異。

表5 乳酸菌發酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞血清細胞因子含量的影響

2.4 乳酸菌發酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞免疫球蛋白含量的影響 如表6 所示，IgA、IgM、IgG、NDV-Ab含量在4 組間均為發酵飼料組＞對照組＞乳酸菌阻斷劑組＞基礎阻斷劑組（P＜0.05）。

2.5 乳酸菌發酵飼料對雛雞脾臟PI3K 蛋白和脾臟Akt蛋白表達的影響 如圖1、圖2 和表7 顯示，雛雞脾臟PI3K、Akt 蛋白表達量在4 組間差異顯著，均為發酵飼料組＞對照組＞乳酸菌阻斷劑組＞基礎阻斷劑組（P＜0.05）。

表6 乳酸菌發酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞免疫球蛋白含量和新城疫抗體含量的影響

圖1 PI3K 蛋白電泳圖

圖2 Akt 蛋白電泳圖

表7 乳酸菌發酵飼料對雛雞脾臟PI3K、Akt 蛋白表達的影響

2.6 乳酸菌發酵飼料對雛雞脾臟PI3K、Akt mRNA 表達的影響 如表8 所示，雛雞脾臟PI3K、Akt mRNA表達量均為均為發酵飼料組＞對照組＞乳酸菌阻斷劑組＞基礎阻斷劑組（P＜0.05）。

表8 乳酸菌發酵飼料對雛雞脾臟PI3K、Akt mRNA 表達的影響

2.7 部分變量間相關性分析 由表9 可知，PI3K mRNA表達量與ADG、T 細胞轉化率、B 細胞轉化率、IL-6、IFN-α、IgM、NDV-Ab 含量呈顯著正相關。Akt mRNA表達量與ADG、IFN-α 含量呈極顯著正相關，Akt mRNA 表達量與T 細胞轉化率、B 細胞轉化率、IL-6含量、IgM、NDV-Ab 含量呈顯著正相關。

3 討 論

3.1 乳酸菌發酵飼料對雛雞免疫功能影響 淋巴細胞是與動物體免疫活性極其相關的細胞，T 細胞反映機體細胞免疫活性，B 細胞反映機體體液免疫的活性。白細胞介素是可以由淋巴細胞產生并作用于淋巴細胞的一類細胞因子，它們在傳遞信息、激活與調節免疫細胞、介導T 和B 細胞活化、增殖與分化方面有重要的作用。其中IL-2 被稱為T 細胞生長因子，它由T 細胞產生，同時又可以活化T 細胞來產生細胞因子。IL-6 可以由活化的T 細胞和B 細胞合成，能夠刺激活化B 細胞增殖，分泌抗體，刺激T 細胞增殖。尹艷軍等[7]研究發現，基礎飼料分別添加1%和2%的乳酸凍干菌均能提高肉雞T淋巴細胞轉化率，促進免疫器官的生長發育。吳妍妍等[8]研究發現，用嗜酸乳桿菌發酵棉粕喂食AA 肉仔雞，與對照組相比，AA 肉仔雞血清中的IgA、IgM、IgG 均顯著提高。本試驗結果顯示，乳酸菌發酵飼料提高了雛雞T、B 淋巴細胞轉化率，提高雛雞IL-2、IL-6、IFN-α 含量，顯著提高雛雞體內免疫球蛋白IgA、IgM、IgG、NDVAb 含量，表明乳酸菌發酵飼料可提高雛雞體液免疫和細胞免疫功能。其可能機制為乳酸菌改善了雛雞腸道環境，增強了其對飼料的消化吸收能力，促生長能力明顯；乳酸菌通過與腸道內其他菌群的生存競爭，減少和抑制了雛雞腸道內的有害菌，使得雛雞抗菌抗病能力增強。

3.2 乳酸菌發酵飼料調控體液免疫和細胞免疫的機制PI3K/Akt 信號通路是一條經典的信號通路，在細胞存活與分化、細胞生長、運動和凋亡等多種生理和病理過程中起作用。近年來通過基因敲除、藥物干預及體外細胞研究等技術發現PI3K 參與T 細胞的發育、活化、增殖及分化，并且研究證明PI3K 信號在T 細胞發育的多個階段起重要作用[9]。T 細胞可能產生或者促進產生一些細胞因子（如IL-2），它可以促進B 細胞增殖和分泌抗體。張彤瑤[10]研究發現，金針菇菇腳通過激活PI3K/Akt 信號通路增強了肉雞免疫功能。本試驗給雛雞飼喂基礎飼料或乳酸菌發酵飼料，在口服PI3K 阻斷劑時，均顯著降低雛雞PI3K、Akt mRNA 和蛋白的表達以及雛雞體液免疫和細胞免疫水平。通過變量間相關性分析結果可知，PI3K mRNA 表達量與雛雞平均日增重、T 細胞轉化率、B 細胞轉化率、IL-6、TFN-α、IgM、NDV-Ab 含量呈顯著正相關。Akt mRNA 表達量與日增重、IFN-α 含量呈極顯著正相關，Akt mRNA表達量與T 細胞轉化率、B 細胞轉化率、IL-6 含量、IgM、NDV 抗體含量呈顯著正相關。其可能機制為乳酸菌激活了PI3K/Akt 信號通路，刺激B、T 淋巴細胞的增殖，因此增強了動物體免疫功能。

表9 部分變量間相關性分析

4 結 論

本試驗結果表明，乳酸菌發酵飼料可以提高SPF雞體液免疫和細胞免疫功能，主要是通過激活SPF 雞PI3K/Akt 信號通路來提高機體的免疫功能。