ASIP 基因第3 外顯子349 位點多態性與中國家驢毛色表型相關研究

蘇詠梅，朱文進，周 曉，張同玉，李祥龍，吳建華

（河北科技師范學院動物科技學院，河北秦皇島 066600）

毛色是家畜品種的主要特征，是識別家畜品種和個體的重要依據和主要標志，毛色做為家畜生物學性狀其經濟價值在不同家畜及其類型中差異很大[1]。中國家驢的毛色沒有馬的復雜，但也多種多樣，且各地命名不一。中國家驢的毛色基本可分為單色毛和混合色毛兩大類，其中單色毛主要有純黑色和白色2 種，這類毛沒有雜色，且終生不變；混合色毛主要有粉黑色、皂角黑色、灰色、青色、蒼色、栗色、銀河毛和花毛等，這類毛色由不同毛色混雜或毛色隨年齡的增長深淺有變化[2]。

驢是傳統的役用動物，對其毛色的選育和研究較少[3-11]。ASIP 基因是家畜毛色性狀的主要候選基因之一。Abitbol 等[3]在對法國驢毛色的研究中發現，純黑色驢 ASIP 基因編碼區第3 外顯子有1 處隱性錯義突變（c.349 T＞C），使該位點編碼的氨基酸發生變異（由半胱氨酸變為精氨酸），進而使黑色素合成累積，被毛呈黑色。驢ASIP 基因的錯義突變（c.349 T＞C）可以形成CC 型、TC 型與TT 基因型，其中CC 基因型驢被毛為純黑色，TC 與TT 基因型驢被毛為非純黑色。為了解中國家驢毛色是否與ASIP 基因的該錯義突變（c.349 T＞C）有關，本研究對中國家驢16 個品種 680 個體的ASIP 基因進行分析，為中國家驢毛色性狀的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 實驗用16 個驢品種血樣采自河北、山西、山東、內蒙古、甘肅、陜西、新疆、寧夏、河南9個省的16 個地區，共計680 頭驢的血樣。驢的品種、數量、采樣地及其毛色特征見表1。血樣采自前腔靜脈，ACD 抗凝，低溫帶回實驗室，分裝出3 mL 的一小份，4℃保存備用，其余置于-70℃凍存。

1.2 總基因組DNA 的提取與PCR 擴增 總DNA 的提取采用常規酚-氯仿抽提法[12]，特異性引物是參考文獻[3]的序列，由北京賽百盛基因技術有限公司合成，引物的上游序列為5'-GGCCTCCATAGTCCAAAGAGC-3'；下游序列為5'-TTGCAGAAGGGACCTCAGGGT-3'。PCR 反應體系為25 μL：2×Es Taq Master Mix 12.5 μL，上下游混合引物1.5 μL（10 pmol/μL），DNA 模板2 μL（10 ng/μL），去 離 子 水9 μL，2×Es Taq Master Mix購自世紀康為公司（CWBIO）。PCR 反應條件：94℃預變性6 min；94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸40 s，32 個循環；72℃修復延伸10 min。

PCR 產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將符合要求的PCR 產物進行下一步實驗酶切或直接送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序，PCR 產物膠純化試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 PCR-RLFP 分析 酶切體系為20 μL：10×NE Buffer 2 μL，限制性內切酶Brs Ⅰ（10 U/μL，NEB 公司）0.4 μL，PCR產物10 μL，dd H2O 7.6 μL。65℃酶切20 min，80℃失活20 min，冷卻后用2%的瓊脂糖凝膠電泳（電壓120 V 電泳1.5～2 h）。Bio-RAD 凝膠成像系統成像觀察酶切效果，并記錄分型。

1.4 統計分析 根據PCR-RLFP 分析結果，記錄所有樣品檢測位點基因型，根據參考文獻[13]計算公式，采用Excel 計算、統計基因型和基因頻率。

2 結果與分析

2.1 中國家驢毛色特征 從表1 看出，中國家驢毛色以粉黑色、灰色和皂角黑色為主，另外還有少量純黑色、青色和栗色，蒼色、銀河色和白色很少見，在采樣過程中沒有見到花色驢。大型驢和中型驢的毛色以粉黑色為主，小型驢的毛色以灰色為主；皂角黑為過度毛色，在大、中和小型驢中均有分布，每個驢品種的毛色有5 種以上，盡管有些毛色在一些品種中很少，這說明中國家驢選育程度較低。

2.2 中國家驢ASIP 基因的變異位點 選擇有毛色性狀記錄個體的烏頭黑驢6 頭、粉黑驢6 頭、皂角黑6 頭灰色驢6 頭、青色驢 6 頭、栗色6 頭、蒼色5 頭、銀河4 頭和白驢 2 頭，共計47 頭，對其ASIP 基因 PCR擴增產物測序（圖1）表明，在中國家驢品種中存在ASIP 基因第3 外顯子 c.349 T＞C 的突變。

圖1 中國家驢ASIP 基因第3 外顯子的突變位點

表1 實驗用驢種、數量、采樣地及毛色特征

2.3 中國家驢ASIP 基因的SNP 多態性 從圖2 可以看出，ASIP 基因的PCR 產物在340 bp 位置與目的片段一致，而且條帶清晰，特異性好；純黑色驢的基因型以CC 為主，其酶切帶型為340 bp 1 條帶，表明不能被BsrⅠ內切酶切開；非純黑色驢的基因型為TT型或TC 型，未檢測到CC 基因型；TT 型純合子酶切帶型為209 bp 和131 bp 2 條，TC 型雜合子帶型為340、209、131 bp 3 條，均表明能被Bsr Ⅰ內切酶切開。中國家驢ASIP 基因第3 外顯子PCR-RFLP 表現出明顯的多態性。

在純黑色驢中，CC 基因型的檢出率為89.29%（25/28），純黑色德州驢、廣靈驢、渤海驢和慶陽驢的基因型都是CC 型，檢出率100%，而純黑色晉南驢、陽原驢和新疆驢各有1 個純黑色驢的個體不是CC 型。在非純黑色驢（包括粉黑、皂角黑、灰色、青色、蒼色、栗色、銀河毛和白色）中，TT 或TC 基因型檢出率為99.54%（677/680）。

圖2 驢ASIP 基因的PCR 產物酶切多態性

2.4 中國家驢ASIP 基因的基因型頻率與基因頻率 從表2 可以看出，中國驢CC 型的頻率很低（0.037），TT 型的頻率最高（0.731），C 等位基因的頻率很低（0.153），T 等位基因的頻率很高（0.847）。

3 討 論

關于家驢毛色調控的分子機制研究很少，主要集中在MC1R、ASIP、KTI 和STX17 等基因。Abitbol 等[3]選擇法國登記注冊的6 個品種127 頭驢進行毛色對比試驗，并將這127 頭驢按照毛色分為兩大類，即黑驢（9頭）和三粉驢（118 頭），發現黑驢的ASIP 基因上存在1 處隱性錯義突變（c.349T＞C），導致編碼區第117 位氨基酸由半胱氨酸突變為精氨酸，從而影響黑色素的形成過程，最終產生黑色被毛。Sun 等[8]和李詩穎[11]研究了中國13 個家驢品種590 個體ASIP 基因多態性與家驢毛色的關系，發現中國家驢ASIP 基因同樣存在突變位點c.349T＞C，與Abitbol 等[3]研究結果一致，且突變位點c.349T＞C 可以將中國驢分為純黑色驢（CC 型）和非黑色驢（TT 型或TC 型）。本研究同樣證明，中國家驢ASIP 基因存在突變位點c.349T＞C，但與Abitbol 等[3]和Sun 等[8]研究不同的是在28 個純黑色被檢驢中有3個體不屬于CC 基因型。非純黑色驢中沒有檢測出CC基因型，只檢測出TT 和TC 基因型，且TT 或TC 基因型的分布在不同品種和不同毛色中沒有規律性，這與Sun 等[8]和李詩穎[11]的研究結果一致。

表2 中國16 個地方驢品種ASIP 基因的基因型頻率與基因頻率

在中國家驢品種中，純黑色的個體較少，主要分布在德州驢及其周邊驢種——渤海驢中。純黑色驢在德州驢中占樣本量的15.39%，渤海驢占14.82%。這與李詩穎[11]報道的德州驢純黑色個體占樣本量的比例為48.89%出入較大，這可能與采樣對象或目的不同有關，本研究樣品采自山東寧津的自然群體，而李詩穎[11]采自山東德州、東阿集團養殖場的驢群，可能經過有目的的選擇或是為了專門研究純黑色驢而采集純黑色驢較多。Abitbol 等[3]發現，影響家驢毛色的ASIP 基因從三粉驢到黑色驢為隱性遺傳，這解釋了家驢中純黑色個體少的原因。

純黑色德州驢體型偏重，動作較遲鈍，為中國驢種中的“重型驢”[14]；另外，德州驢皮是熬制阿膠的道地藥材，特別是其中的純黑色驢皮，被認為是極品阿膠的原料[15]，這也可能是德州驢中純黑色驢多的原因。本研究中純黑色驢個體基因型全部是CC 型。由此可見，利用ASIP 基因第3 外顯子PCR-RFLP 標記對培育純黑色的肉皮兼用的驢新品系或品種具有重要的指導意義。

4 結 論

中國家驢ASIP 基因第3 外顯子存在c.349 T＞C 突變，PCR-RFLP 標記可以區分中國家驢純黑色與非純黑色，可以作為純黑色家驢選育的分子標記。