調控民豬ZBED6 基因轉錄元件的篩選與分析

張冬杰，劉 洋，汪 亮，李忠秋，劉 娣,*

（1.黑龍江省農業科學院畜牧研究所，黑龍江哈爾濱 150086；2.農業農村部種養結合重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150086；3.東北農業大學動物科技學院，黑龍江哈爾濱 150030）

胰島素樣生長因子2（Insulin-like Growth Factor-2，IGF2）是20 世紀70 年代發現的一種促生長因子，在胎兒生長發育、肌肉生長以及基因印跡等方面具有重要的調控作用[1]。2003 年，van Laere 等[2]研究發現，豬IGF2 基因內含子3 中的單堿基突變（G3072A）會導致骨骼肌中IGF2 表達量上調3 倍、瘦肉率升高、皮下脂肪減少。究其原因是單堿基突變（G3072A）破壞了轉錄調控因子鋅指蛋白ZBED6（Zinc Finger BED-Type Containing 6，ZBED6）的結合位點，使其無法正常結合到IGF2 基因上，至此，ZBED6 基因作為IGF2 的轉錄抑制因子進入人們的視線。

ZBED6 是鋅指蛋白家族的一員，在胎盤哺乳動物中極其保守。ZBED6 基因無內含子，是從一個馴化的DNA 轉座子進化而來，位于ZC3H11A（Zinc Finger CCCH-Type Containing 11A）基因的第1 個內含子中，其編碼蛋白包含2 個BED 結構域和1 個hATC 二聚體功能域。如果在小鼠的C2C12 成肌細胞中沉默ZBED6，IGF2 的表達水平會顯著上升、細胞增殖能力增強、傷口愈合進程加快。同時發現，ZBED6 在C2C12 細胞基因組上的結合位點超過2 000 個，其中包括很多與發育和轉錄調控相關的基因[3]。ZBED6 除了通過IGF2 參與調控骨骼肌生長外[4]，還會抑制胰島素的產生、細胞聚合以及神經元的分化[5]；在同一物種內的表達也具有明顯的時空特異性[6]。由此可知，ZBED6基因的生物學功能非常復雜，需要不斷探索。

為了深入研究豬ZBED6 基因的生物學功能，本研究通過構建系列缺失載體、利用重疊PCR 以及雙熒光素酶檢測技術開展了民豬ZBED6 基因自身轉錄調控的研究，以期獲得調控ZBED6 轉錄的分子元件，為后續該基因的生物學功能研究以及基因編輯等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 民豬基因組DNA，為本實驗室保存。

1.2 民豬ZBED6 基因啟動子區的克隆 在NCBI 中檢索豬的ZBED6 基因（GenBank：XR_001304140.2）的5'側翼序列信息。利用Primer5.0 軟件分別設計上、下游引物A 和R1，預期擴增長度為2 032 bp，位置為-2 053～-21 bp（以翻譯起始密碼子“A”為+1），兩端分別引入酶切位點Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ。引物序列（下劃線為內切酶識別序列）：A：5′-GGTACCGCATTCCTTGGAA AGGCAGGG-3′，R1：5′-AAGCTTTCGTAGCAGAAT CTGTTAGTGGGTT-3′。

以民豬基因組DNA 為模板擴增ZBED6 基因啟動子區域。PCR 反應體系20 μL：DNA 1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，上、下 游 引 物（10 μmol/L）各0.5 μL，ddH2O 補齊；PCR 反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58.3℃退火30 s，72℃延伸120 s，共計30 個循環；最后72℃延伸10 min。擴增結束后，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，觀測到目的條帶后，使用膠回收試劑盒回收目的條帶。將回收后的目的片段連入pMD18-T 載體構建克隆質粒pMD18-ZBED6，反應體系10 μL：Solution Ⅰ5 μL，pMD18-T 0.5 μL，膠回收產物4.5 μL；反應條件：16℃過夜連接。連接結束后將連接產物轉入大腸桿菌DH5α 感受態細胞，轉化產物涂于LB 固體培養基，37℃倒置過夜培養，培養結束后挑取陽性克隆菌落，PCR 鑒定，將陽性克隆送交吉林省庫美生物科技有限公司測序。將序列正確的克隆菌株加入LB 液體培養基內，重新搖菌擴繁后，小規模提取質粒，用于后續載體的構建。

1.3 報告基因質粒pGL3-Basic-ZBED6 的構建 將pGL3-Basic 空載體和pMD18-ZBED6 質粒分別經Kpn I 和HindⅢ雙酶切后，使用T4 連接酶過夜連接，酶切體系10 μL：Hind Ⅲ 0.5 μL；Kpn I 0.5 μL；10×M Buffer 1.0 μL；質粒1.0 μL；ddH2O 7.0 μL。反應條件：37℃水浴10 min。連接體系25 μL：10×T4 DNA 連接Buffer 2.5 μL，DNA片段5 μL，載體1 μL，T4 DNA 連接酶1 μL，ddH2O 15.5 μL，反應條件：14℃過夜連接。連接結束后將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α 感受態細胞中，篩選陽性重組質粒，經菌液PCR 驗證后，嚴格按照無內毒素質粒提取試劑盒說明書操作，提取無內毒素質粒，使用紫外分光光度計進行純度的檢測，檢測合格后，置于-20℃保存備用。

1.4 民豬ZBED6 基因啟動子區系列缺失載體的構建以引物A 和R1 所擴增的片段為基礎，設計7 對系列缺失引物，引物信息見表1，其中R1 為通用下游引物，以重組質粒pMD18-ZBED6 為模板擴增系列截短型片段，反應體系及反應條件同上，退火溫度均為55℃。反應結束后各系列片段按照1.2.2 方法分別連入pGL3-Basic 載體內。第1 輪構建了5 個截短型質粒，分別命名為pB（-1897/-21）-ZBED6、pC（-1863/-21）-ZBED6、pD（-1808/-21）-ZBED6、pG（-1777/-21）-ZBED6 和pH（-1462/-21）-ZBED6。第2 輪構建了2 個截短型質粒，分 別 命 名 為pE（-1800/-21）-ZBED6 和pF（-1787/-21）-ZBED6。

表1 擴增ZBED6 基因截短型啟動子所用引物

1.5 豬腎源PK15 細胞的體外培養 按照Lipofectamine ? 2000 Transfection Reagent 嚴格進行轉染，轉染前1 d 將細胞以4×105～8×105個細胞/孔的密度接種于DMEM 培養基中（24 孔板），第2 天轉染時的細胞要達到80%～90%匯合，按照脂質體∶報告基因質?！胮RLTK 為2 μL∶0.5 μg∶0.00125 μg 的比例共轉染于豬PK15細胞中，轉染4～6 h 后換成含有血清的培養基繼續培養，24 h 后收集細胞，進行熒光素酶活性檢測。以上實驗獨立重復3 次。

1.6 熒光素酶活性檢測 嚴格按照普洛麥格公司生產的雙熒光素酶報告基因檢測系統（Dual-Luciferase Reporter Assay）產品說明書操作：取出24 孔板，棄掉原有細胞培養液，PBS 洗滌細胞1 次，每孔加入100 μL 細胞裂解液，37℃烘箱中放置15 min 后，收集細胞裂解液，離心5 min，取50 μL 上層細胞裂解液加入熒光測定管中，加入30 μL 檢測試劑（Firefly Luciferase，LAR Ⅱ），輕輕混勻后測定發光值，再加入30 μL Stop&GLo，測定Renila 熒光素酶發光值，二者的比值即為熒光素酶相對活性（RLA），RLA 的數值為3 次重復實驗結果的平均值±標準差。

1.7 民豬ZBED6 基因啟動子區調控元件的預測 根據3 個轉錄因子預測網站（http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html、http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3、http://jaspar.genereg.net）對ZBED6 基因的啟動子區進行預測分析。根據預測結果，探討該基因啟動子區可能存在的調控元件。

1.8 民豬ZBED6 基因啟動子區調控元件的篩選與驗證根據在線軟件的預測結果，設計并合成用于ZBED6 基因啟動子區各轉錄因子結合位點缺失的引物，引物序列見表2。利用重疊延伸PCR 法獲得定點突變片段，重疊延伸PCR 主要通過3 個PCR 反應完成：①以Adf-1調控元件的突變為例，首先以pMD18-ZBED6 質粒為模板，用正向側引物A 和突變引物Del- Adf-1-R 進行PCR1 擴增，擴增產物含有突變位點及其上游片段；②以pMD18-ZBED6 質粒為模板，用反向側引物RS 和突變引物Del-Adf-1-F 進行PCR2 擴增，擴增產物含有突變位點及其下游片段；③分別膠回收PCR1 和PCR2 擴增產物，等比例混合后，以此為模板，使用正反向引物A 和RS 進行PCR3 擴增，擴增產物即為引入目的突變的靶序列，然后按照上述方法連入pGL3-basic 載體。其他調控元件缺失載體的構建均按照此方法進行。

2 結 果

2.1 民豬ZBED6 基因啟動子區的克隆測序 以豬耳組織樣DNA 為模板，以特異性引物A 和R1 進行ZBED6基因5′側翼區擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后在2 000 bp 左右發現單一、明亮的條帶，與預期的2 032 bp相符。將目的片段純化、克隆測序后與NCBI 數據庫中豬的ZBED6 基因（登錄號為XR_001304140.2）序列相比，相似度為99.26%，說明序列擴增正確。

2.2 報告基因質粒pGL3-Basic-ZBED6 的構建 從圖1可見，雙酶切后，有一條長約2 000 bp 的片段從質粒中成功切下，與連入的ZBED6 基因片段大小相符，說明目的片段已成功連入pGL3-Basic 載體。

圖1 pA（-2053/-21）-ZBED6 質粒酶切鑒定圖譜

圖2 pA（-2053/-21）-ZBED6 雙熒光素酶活性分析

表2 ZBED6 基因啟動子區調控元件缺失突變所用引物

2.3 熒光素酶活性檢測 如圖2 所示，與空白對照相比，pA（-2053/-21）-ZBED6 具有明顯的啟動子活性，表明-2 053～-21 bp 片段內含有調控民豬ZBED6 基因轉錄的調控元件。2.4 第1 輪系列長度缺失載體的構建 如圖3 所示，第6 泳道是最長的原始片段pA（-2053/-21），長度為2 032 bp，從右至左，依次截短，至第1 泳道為最短的pH 片段，長度為1 441 bp。

圖3 民豬ZBED6 基因啟動子截短型報告基因質粒酶切鑒定圖譜

2.5 第1 輪系列載體的雙熒光素酶活性分析 如圖4 所示，重組質粒pB（-1897/-21）-ZBED6 和pC（-1863/-21）-ZBED6（P＜0.05）、pC（-1863/-21）-ZBED6（P＜0.05）和pD（-1808/-21）-ZBED6（P＜0.05）、pD（-1777/-21）-ZBED6 和pG（-1808/-21）-ZBED6（P＜0.01）之間的雙熒光素酶活性存在顯著差異，預測-1 897～-1 863 bp、-1 863～-1 808 bp 以 及-1 808～-1 777 bp 存 在 調 控ZBED6 基因轉錄的增強子，其中-1 808～-1 777 bp 片段距離“ATG”起始密碼子最近，而且該片段的缺失造成了啟動子活性的極顯著降低，因此后續研究主要以該片段為主。

圖4 截短型啟動子熒光素酶活性分析

2.6 第2 輪系列長度缺失載體的構建及雙熒光素酶活性的測定 根據第1 輪重組質粒的雙熒光素酶活性測定結果，推測在-1 808～-1 777 bp 存在1 個正調控元件，據此構建第2 輪系列長度缺失載體。如圖5 所示，pD 截短至pE 后啟動子活性降低（P＜0.01）；pE 截短至pF后啟子活性降低（P＜0.05）；pF 截短至pG 后啟動子活性降低（P＜0.05）。根據熒光信號的強弱，推測pD 和pG 之間即-1 808～-1 777 bp 存在重要的轉錄增強子，尤其是-1 808～-1 800 bp。

圖5 截短型啟動子熒光素酶活性分析

2.7 核心區域的調控元件預測 根據上述檢測結果，利用在線生物學軟件對-1 808～-1 777 bp 區間潛在的轉錄因子結合位點進行了預測。綜合3 個網站的預測結果，初步選定結合位點為-1 805～-1 798 bp 的Adf-1、-1 814～-1 803 bp 的HINFP 和-1 787～-1 774 bp 的CREB3 作為潛在的轉錄調控元件開展下一步研究。

2.8 潛在的轉錄元件缺失突變分析 以pA（-2053/-21）-ZBED6 質粒為模板，以重疊延伸PCR 中第3 輪擴增用的A 和RS 為引物，擴增片段，連入pGL3-Basic 載體，構建陽性對照重組質粒（-2053/-1565）-pGL3，以pGL3-Basic 空載體為陰性對照，同時檢測陽性對照、陰性對照和各轉錄元件缺失報告基因載體的雙熒光素酶活性。如圖6 所示，缺失CREB3、Adf-1 和HINFP 轉錄元件后，雙熒光素酶活性均顯著降低（P＜0.05）。

圖6 不同元件缺失對ZBED6 基因啟動子活性的影響

3 討 論

真核生物的啟動子包括核心啟動子區和上游序列區，核心啟動子區位于結構基因的5'端上游，能活化RNA 聚合酶，使之與模板DNA 準確地結合并具有轉錄起始的特異性，在該區內還存在許多短的核苷酸序列，為轉錄因子結合位點[7]。轉錄因子是基因表達調控過程中的重要調節因子，它與RNA 聚合酶Ⅱ形成轉錄起始復合體，共同參與轉錄起始過程。轉錄因子主要分為2種，一種是非特異性轉錄因子，非選擇性的調控基因轉錄；另一種是特性轉錄因子，它們能夠選擇性地調控某種或某些基因的轉錄。同時，不同的轉錄因子之間還可以通過多種方式相互結合，為這一調控過程提供了更多的可能[8]。

大約在2 億年前，一個DNA 轉座子整合到一種原始哺乳動物的基因組中，數百萬年后，它在所有胎盤哺乳動物的共同祖先中進化出一種基本的功能[9]，這個轉座子現被命名為ZBED6，在多個組織內廣泛表達，是非特異性轉錄因子。Huang 等[10]發現，黃牛的ZBED6基因的啟動子核心區位于-866 bp～-556 bp，其-826G＞A的突變會造成轉錄因子PLZF 結合位點的改變，野生型M-826G-pGL3 的啟動子活性顯著高于突變型。ZBED6最早是在豬的肌肉組織中發現的，為了全面深入了解該轉錄因子的遺傳學特性，本研究采用系列截短的方式，篩選民豬ZBED6 基因的核心啟動子區。

最初，根據傳統經驗構建了一段長約1 000 bp 的ZBED6 基因5'端上游序列的報告載體，但經雙熒光素酶檢測后發現，此片段無啟動子活性。隨后，將片段延伸至上游2 000 bp，再次檢測發現此片段具有明顯的啟動子活性，說明轉錄因子在ZBED6 啟動子區上的識別位點距離編碼區較遠。通過構建一系列缺失片段的報告載體，最終發現該基因上游啟動子區從-1 808 bp 至-1 777 bp 的片段具有明顯的啟動子活性，推測調控ZBED6基因轉錄的反式作用因子位于-1 808～-1 777 bp。利用在線軟件預測及雙熒光素酶實驗驗證發現，定點缺失掉Adf-1、HINFP 和CREB3 轉錄因子的結合位點后，ZBED6 基因的啟動子活性均發生顯著降低，尤其是Adf-1 轉錄因子結合位點的缺失，啟動子活性下降最為顯著，預測結果與驗證結果基本一致。

轉錄因子HINFP 是一個具有2 種不同功能的轉錄因子，根據細胞環境不同，可以激活或抑制靶基因的轉錄，但其通常需與其他物質形成復合體后才能發揮作用。如在細胞周期由G1 期向S 期轉變的過程中，HINFP 需與NPAT（Nuclear Protein Ataxia-Telangiectasia）蛋白形成轉錄復合體后才會作用于組蛋白H4 的啟動子[11]。轉錄因子Adf-1 是Myb 基因家族的一員，Myb 基因家族是一類重要的轉錄因子家族，廣泛分布在動物、植物、真菌和原生生物中，是植物中最大的一類轉錄因子，參與植物發育和代謝的網絡調節等生命過程。Adf-1 可通過調節細胞粘附和mRNA 轉運2 個關鍵過程控制果蠅大腦內樹突的發育[12]。轉錄因子CREB3 是ATF（激活轉錄因子）/CREB（cAMP 反應元件結合蛋白）家族中重要的一員，是真核生物中廣泛存在的一類基礎轉錄因子，該家族共同的結構特征是堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）模體。該家族蛋白涉及到細胞的增殖、分化、凋亡、胞外刺激和應激反應等細胞生命過程[13]。

4 結 論

民豬ZBED6 基因的轉錄調控機制較為復雜，其啟動子區存在HINFP、Adf-1 和CREB 3 等多個調控元件的結合位點。