添加低劑量大豆卵磷脂稀釋液低溫保存綿羊精液的優(yōu)化研究

王 杰，趙建清，李 娜，芮 雪，高慶華,3*

（1.新疆塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300）

用無動物源性成分替代稀釋液中卵黃是近年的研究趨勢[1-2]。植物性大豆卵磷脂具有制備簡單、易于標(biāo)準(zhǔn)化操作、效果穩(wěn)定等優(yōu)點，已作為一種卵黃替代物，用于防止動物源性污染以確保生物安全[3-4]。卵黃中卵磷脂含量約為10%，TRIS 專利稀釋液中卵黃含量約為23%，換算到稀釋液中卵磷脂含量約為3%，本實驗室以TRIS 專利稀釋液卵黃中卵磷脂等量（3%）大豆卵磷脂替代卵黃，用1.25%～10%濃度大豆卵磷脂替代TRIS專利稀釋液中卵黃設(shè)計試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最低（1.25%）添加量低溫保存效果最好且濃度越高保存效果越差，但未能確定添加1.25%以下濃度大豆卵磷脂是否具有更佳效果[5]。TRIS 稀釋液制成粉劑后低溫保存綿羊精液具有與TRIS 稀釋液相同的效果[6]，但是大豆卵磷脂稀釋液制成粉劑是否具有相同效果未可知。本實驗擬用1.25%以下濃度的大豆卵磷脂替代卵黃稀釋液中卵黃低溫保存綿羊精液并將最優(yōu)組制成粉劑，進(jìn)一步探討大豆卵磷脂稀釋液及其粉劑對綿羊精液低溫保存效果。

1 材料與方法

1.1 稀釋液的制備 將大豆卵磷脂加入去卵黃的主要成分包括TRIS、檸檬酸、果糖、ATP、維生素C、BSA、青鏈霉素的TRIS 專利稀釋液基礎(chǔ)液中混勻備用，稀釋液粉劑采用真空冷凍干燥法制得。

TRIS 稀釋液基礎(chǔ)液配方：雙蒸水136 g、果糖2 g、Tris 4.84 g、檸檬酸2 g、ATP 100 g、BSA 300 mg、維生素C 600 mg、青霉素40 萬單位+鏈霉素20 萬單位。

1.2 精液采集與保存 挑選2～4 歲體況良好無繁殖障礙且經(jīng)過調(diào)教的盤羊與巴士拜羊雜交公羊，實驗前40 d補(bǔ)飼胡蘿卜、雞蛋，加強(qiáng)運動，實驗前1 周排精檢查。實驗時觀測精液色澤、氣味、云霧狀和射精量，2 位實驗人員同時用細(xì)胞計數(shù)儀測定正常精液精子密度和活率，結(jié)果取兩者觀測平均值，只有向前推進(jìn)運動率高于80%的精液用于實驗，將精液稀釋至約5×108/mL，水浴在冰箱中2 h 左右降溫至0℃，并在冰水混合物中保存。

1.3 精液品質(zhì)鑒定 精子活率檢測：將精液在冰箱內(nèi)輕微混勻后，取5 μL 精液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，放在37℃熱臺上在400 倍顯微鏡下進(jìn)行檢測，2 位實驗人員同時用10 分制觀測，觀測值相差1 分以內(nèi)為有效數(shù)據(jù)，重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

精子頂體完整率檢測：吸取1 滴精液滴于載玻片的左端，用另一張邊緣光滑的載玻片呈35°角自右面接觸液滴，拉向另一側(cè)，制成抹片，經(jīng)自然風(fēng)干5～10 min 后，用福爾馬林磷酸鹽固定液進(jìn)行固定15 min，再經(jīng)水洗干燥后，用姬姆薩染液對抹片精子進(jìn)行染色90 min，再用蒸餾水沖洗、干燥，顯微鏡下觀察頂體完整的精子數(shù)，重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 實驗一 實驗一共分6 個組：0%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%大豆卵磷脂組。挑選15 只公羊，將每只羊采集精液平均分為2 份后用6 組稀釋液兩兩交叉稀釋。重復(fù)3 次。將綿羊新鮮精液稀釋后低溫保存，在第0、1、4、7、10、12、18 天對精子活率、頂體完整率進(jìn)行測定。

1.4.2 實驗二 在實驗一選出的最優(yōu)大豆卵磷脂濃度組后，將最優(yōu)組（0.5%大豆卵磷脂組）和TRIS 卵黃稀釋液經(jīng)過干燥處理制成稀釋液粉劑，避光保存30 d 后低溫保存綿羊精液。挑選3 只公羊，將每只羊采集精液平均分為2 份，分別與最優(yōu)粉劑組和TRIS 稀釋液粉劑組等溫混合。重復(fù)3 次。在保存第0、1、4、7、10、12天對精子活率和頂體完整率進(jìn)行測定。

將最優(yōu)粉劑組和TRIS 稀釋液粉劑組低溫保存第10天綿羊精液進(jìn)行人工授精，40 d 后用B 超（GDF-K6）統(tǒng)計受胎率。選擇無繁殖障礙、體況良好繁殖母羊240 只，任意一天用放栓器放入陰道海綿栓，放置12 d 后撤栓，撤栓時每只母羊肌肉注射330 單位孕馬血清促性腺激素（PMSG），撤栓48 h 后經(jīng)公羊試情，判定發(fā)情母羊間隔8～12 h 子宮頸外口輸精2 次，每次輸精0.4 mL，有效精子數(shù)達(dá)1×108個。

1.5 統(tǒng)計分析 精子活率、頂體完整率用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，受胎率進(jìn)行卡方檢驗，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度大豆卵磷脂替代TRIS 稀釋液中卵黃低溫保存綿羊精液情況

2.1.1 大豆卵磷脂替代卵黃對綿羊精子活率的影響 由表1 可知，保存第1 天開始0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%組精子活率高于0%組（P＜0.05），第10 天開始0%、0.25%組精子活率低于其他組（P＜0.05）。0.5%、0.75%、1.0%、1.25%組保存第10 天精子活率均大于50%，滿足鮮精輸精要求。0.5%組保存第18 天精子活率為18.6%，略高于0.75%組（P＞0.05），高于1.0%、1.25%組（P＜0.05）。

2.1.2 大豆卵磷脂替代卵黃對綿羊精子頂體完整率的影響 由表2 可見，各組頂體完整率均隨保存時間推遲逐漸降低，頂體完整率在各時間點均無顯著差異，隨著保存時間延長精子頂體損傷率逐漸增高。

表1 不同濃度大豆卵磷脂替代卵黃低溫保存綿羊精子對精子活率的影響 %

表2 不同濃度大豆卵磷脂替代卵黃對低溫保存綿羊精子頂體完整率的影響 %

表3 添加0.5%大豆卵磷脂稀釋液粉劑及TRIS 粉劑對低溫保存綿羊精子活率和頂體完整率的影響 %

2.2 稀釋液粉劑低溫保存綿羊精子對精子活率和頂體完整率的影響 由表3 可知，添加0.5%大豆卵磷脂稀釋液粉劑和TRIS 稀釋液粉劑低溫保存綿羊精液精子活率緩慢降低，自保存第1 天起0.5%大豆卵磷脂稀釋液粉劑組精子活率均低于TRIS 稀釋液粉劑組，但各時間點精子活率差異均不顯著。保存第10 天2 組精子活率均大于50%，滿足國家鮮精輸精標(biāo)準(zhǔn)。2 種稀釋液粉劑低溫保存綿羊精子頂體完整率逐漸降低，0.5%大豆卵磷脂稀釋液粉劑組頂體完整率第4～7 天小于TRIS 稀釋液粉劑組，第10～12 天大于TRIS 稀釋液粉劑組，但2 組稀釋液粉劑頂體完整率在各時間點均無無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3 人工授精效果 由表4 可見，0.5%大豆卵磷脂稀釋液粉劑組受胎率65.49%，TRIS 稀釋液粉劑組受胎率67.65%，2 組受胎率差別不顯著且妊娠效果比較理想。

表4 添加0.5%大豆卵磷脂稀釋液粉劑及TRIS 粉劑低溫保存綿羊精液第10 天人工授精情況

3 討 論

3.1 不同濃度大豆卵磷脂替代稀釋液中卵黃對綿羊精液低溫保存的影響 TRIS 專利稀釋液經(jīng)過長期實踐檢驗具有很好的應(yīng)用效果，但是隨著近年來對生物安全的重視以及對稀釋液的研究，卵黃動物源性和成分不確定的問題已不能滿足生產(chǎn)中的需求。Forouzanfar 等[7]用1%大豆卵磷脂冷凍保存綿羊精液，發(fā)現(xiàn)冷凍后精子活力、發(fā)育能力高于15%卵黃，證明了大豆卵磷脂替代稀釋液中卵黃的可行性。本實驗以0%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%濃度大豆卵磷脂替代TRIS 專利稀釋液中的卵黃，0.5%組大豆卵磷脂添加量低溫保存綿羊精液效果最優(yōu)，與孟娜娜等[8]0.375%添加量較為接近，本實驗中保存第10 天的精子活率達(dá)到53.1%，頂體完整率達(dá)到較高水平，滿足鮮精輸精要求；0.5%組保存第18 天精子活率為18.6%，略高于0.75%組（14.3%），顯著高于其他組，可能是隨著大豆卵磷脂濃度增高，稀釋液的粘稠度增高會影響精子活率[9]。0.5%大豆卵磷脂含量低于TRIS 稀釋液卵黃中卵磷脂含量，但保存效果最優(yōu)的原因可能是卵黃中不飽和脂肪酸含量比大豆卵磷脂低，而不飽和脂肪酸是卵磷脂中維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)最主要的成分[10]，卵黃內(nèi)部成分對精子存活具有不利影響，降低精子保存時間[11]。0.5%、0.75%、1.0%、1.25%大豆卵磷脂添加組在前12 d 差別不大，都具有較好的保存效果。0%組未加入抗冷凍保護(hù)劑仍然具有一定的保存效果，保存12 d 精子活率仍能達(dá)到20.5%，可能是精清對維持精子活率具有一定的作用[12]。

3.2 稀釋液粉劑對綿羊精液低溫保存的影響 稀釋液粉劑的研究不僅克服了液體易變質(zhì)、易損壞的弊端，明顯地減輕體積和重量，更便于大批量運輸和儲存，使運輸和儲存費用大幅度下降[13]，也可以規(guī)范稀釋液的生產(chǎn)流程，降低稀釋液的保存條件，擴(kuò)大稀釋液的適用范圍以及實現(xiàn)稀釋液的商品化。本實驗以0.5%大豆卵磷脂組和TRIS 專利稀釋液制成粉劑保存綿羊精液，2 組在各時間點精子活率、頂體完整率差異均不顯著，在保存10 d 時精子活率均高于50%，滿足國家鮮精輸精標(biāo)準(zhǔn)，且頂體完整率高于65%，與陳曉利等[14]使用TRIS 專利稀釋液保存效果相同，可能是真空冷凍干燥對大豆卵磷脂稀釋液粉劑中生物活性影響較小。大豆卵磷脂稀釋液粉劑具有與卵黃稀釋液相似的保存效果。

3.3 稀釋液粉劑低溫保存綿羊精液人工授精效果 受胎率是檢驗精液及稀釋液品質(zhì)的最佳指標(biāo)。本實驗中，0.5%大豆卵磷脂稀釋液粉劑和TRIS 專利稀釋液粉劑2組受胎率無統(tǒng)計學(xué)差異，分別為65.49%和67.65%，略低于費俊陽等[15]70%的受胎率，但已達(dá)到鮮精輸精受胎效果，鮮精輸精受胎率為50%～80%[16]，可以進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)且具有理想的受胎效果，證明大豆卵磷脂稀釋液粉劑能夠用于綿羊精液低溫保存。

4 結(jié) 論

本實驗條件下，綿羊精液低溫保存稀釋液中添加0.5%大豆卵磷脂替代卵黃效果最佳；添加0.5%大豆卵磷脂的稀釋液制成粉劑低溫保存綿羊精子有效期達(dá)10 d。