不同稀釋液中添加十二烷基硫酸鈉對吐魯番黑羊精液冷凍保存的影響

宋玉坤，張 博，吳 昊，王 輝，郜 宇，努日比婭姆·買買提托合提，趙 茜，王旭光，劉國世，阿布力孜·吾斯曼*

（1.新疆農業大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.中國農業大學動物科學技術學院，北京 100193；3.徽商生態牧業有限公司，新疆吐魯番 838100）

冷凍保存技術作為精液長期保存方法，可以提高種公羊的利用率、隔絕疾病擴散和保種[1]，但由于綿羊精子不耐凍，解凍后常常出現精子活率、頂體完整率、受胎率降低等，導致綿羊精液冷凍保存技術未能在生產中廣泛推廣[2]。綿羊的精液冷凍保存技術研究已取得了許多重要成果，但未得到突破性進展。吐魯番黑羊是新疆吐魯番托克遜縣農牧民長期自然選育形成的優質地方品種，其對炎熱干旱環境適應性強且羔羊肉品質優良[3]。近幾年吐魯番黑羊數量急劇減少，優化吐魯番黑羊精液冷凍保存技術顯得尤為重要。

十二烷基硫酸鈉（SDS）是一種表面活性劑，可作為精子冷凍稀釋液保護劑。在稀釋液中添加SDS 以提高精液冷凍保存效果的研究已在多種動物上開展，解凍后的精液品質得到改善[4-5]，而在綿羊精液冷凍稀釋液中添加SDS 的研究尚未見報道。本研究比較了在不同稀釋液配方Tris-葡萄糖-檸檬酸鈉和蔗糖-葡糖糖-檸檬酸鈉為基礎液中添加不同濃度SDS 對吐魯番黑羊精液冷凍效果的影響，并與法國卡蘇商品化OPtidyl 稀釋液做對照，進而篩選出適合吐魯番黑羊精液冷凍稀釋液配方和SDS 添加濃度，為綿羊精液冷凍保存技術的推廣及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗羊為吐魯番托克遜縣徽商生態牧業有限公司的性欲正常、體況健壯、2～4 歲的5 只吐魯番黑羊種公羊。

1.2 試劑及配制

1.2.1 主要試劑 十二烷基硫酸鈉購于法國mofa，青霉素和鏈霉素購自Amresco 公司，其余藥品均采購自Sigma 公司。

1.2.2 稀釋液配制 實驗采用3 種稀釋液，Tris-葡萄糖-檸檬酸鈉為I 液，蔗糖-葡糖糖-檸檬酸鈉為II 液，法國卡蘇商品化OPtidyl 稀釋液（REF:020996，500 mL）做對照為III 液。I 液和II 液均為一步法稀釋，成分見表1。首先配制基礎液，高壓消毒后過濾，加20%（v/v）新鮮卵黃，青、鏈霉素各10 萬單位，添加6%（v/v）甘油，配制成冷凍稀釋液。III 液為2.5×濃儲，用超純水進行稀釋使用。

1.2.3 熒光染料配制 JC-1 為5 mg/mL，生理鹽水稀釋8 倍后約為1 mmol/mL；PI 為1 mmol/mL，FITC-PNA為0.1 mg/mL。

1.3 精液采集 采用常規的假陰道法采集精液，每只公羊每天采精2 次，采完后迅速送回實驗室進行初步的精液品質檢查，精液的顏色、氣味和密度正常，精子活率在70%以上才可用于實驗。將檢測合格后的公羊精液混合均勻，放到滅菌試管中備用。

1.4 精液處理 精液常規檢查后，在30℃環境下用不同稀釋液進行6 倍等溫稀釋。隨即將精液平均分9 份，分別裝在15 mL 滅菌離心管中，用3 種冷凍稀釋液分別添加不同濃度的SDS（0、1%、2%），共9 管。把精液與稀釋液輕輕混勻后分裝到0.25 mL 細管中，用封口粉封口，裹上8～10 層紗布放入4℃冰箱，1～1.5 h 后溫度降至7～10℃放冰袋降溫，3 h 降溫至4℃。

1.5 精液冷凍保存 將自制碼架置于泡沫盒中，低溫溫度計探頭與碼架相連，且探頭與細管處于同一高度，往泡沫盒中倒入液氮，使低溫溫度計顯示溫度在-80～-120℃，此時碼架與液氮面距離約3 cm。將平衡好的細管精液攤放在碼架上，熏蒸8 min 后投入液氮。然后裝到指型管放到紗布袋內，轉移到液氮罐中。

1.6 精液解凍 從液氮罐中取出細管凍精，迅速放到37℃解凍杯中15 s，隨后取出細管精液用于樣品檢測。

1.7 精液品質檢測 用微量移液槍取少量平衡后或解凍后的精液滴到精子計數板上，待到精子鋪滿計數槽，將計數板置于精子分析儀上，用精子分析系統（CASA）進行常規分析。

1.8 精液質膜完整性檢測 根據CASA 常規分析后，篩選出在試驗組中冷凍復蘇后精子活力參數最佳的4組，進行精子的質膜完整性測定。采用HyPo-osmotic swelling test 方法檢測精子質膜的完整性，按照精液與低滲液1∶10 的比例37℃混合孵育30 min，孵育結束后取10 μL 滴片，200×相差顯微鏡下觀察，精子尾部形成一個圓環則為精子質膜完整的精子，沒有形成圓環的則為質膜損傷的精子。

1.9 精液流式細胞儀檢測 選取上述4 個樣品，25℃孵育3 h 后離心去除上清液，再用PBS 稀釋，每組再取3份十分之一的精液用PBS 稀釋至1 000 μL，分別加入PI 和FITC-PNA 用于檢測頂體完整率，加入JC-1 用于檢測線粒體膜電位（MMP）。其中加入JC-1 后37℃避光孵育30 min，其他處理孵育5 min。孵育完畢后上流式細胞儀檢測。

1.10 統計分析 數據采用Excel 2016 進行整理，SPSS 23.0 軟件進行t 檢驗和方差分析，結果均采用平均值±標準差。每組數據重復6 次實驗以上。

2 結 果

2.1 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍前后運動形態的影響 如表2 所示，各組之間在平衡后活力、畸形率、直線運動速率差異不顯著。冷凍后I 液1% SDS 組精子活率最高，與I 液2% SDS 組精子活率無差異，顯著高于其他7 組。冷凍后III 液1% SDS 組畸形率顯著低于II液0% SDS 組、II 液2% SDS 組 和III 液2% SDS 組，與其他組差異不顯著。冷凍后I 液1% SDS 組的直線運動速率最高，顯著高于I 液0% SDS 組、II 液2% SDS組和III 液0% SDS 組，與其他組差異不顯著。綜合形態運動指標，I 液1% SDS 組、I 液2% SDS 組、II 液1%SDS 組和III 液1% SDS 組精液冷凍效果較好，可作進一步檢測以確定最優冷凍配方。

2.2 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍后質膜完整性的影響 表3 顯示，I 液1% SDS 組質膜完整率顯著高于I液2% SDS 組和II 液1% SDS 組，與III 液1% SDS 組無顯著差異。

表1 吐魯番黑羊精液冷凍稀釋液成分

表2 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍前后形態運動的影響

表3 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍后質膜完整性的影響（n=6） %

2.3 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍后頂體完整率的影響 如表4 所示，I 液1% SDS 組的頂體完整活精子比率顯著高于II 液1% SDS 組，與其他2 組沒有顯著差異。各組的活精子頂體完整率沒有顯著差異。I 液1% SDS組的頂體完整率與III 液1% SDS 組無顯著差異，但高于I 液2% SDS 組和II 液1% SDS 組（P＜0.05）。

表4 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍后頂體完整率的影響（n=6） %

2.4 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍后線粒體膜電位的影響 由表5 可知，I 液1% SDS 組高線粒體膜電位精子比率顯著高于II 液1% SDS 組，與其他2 組沒有顯著差異。

表5 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍后線粒體膜電位的影響（n=6） %

3 討 論

3.1 冷凍稀釋液對吐魯番黑羊精液冷凍效果的影響 精液冷凍稀釋液主要作用是改善精子外環境的滲透壓與pH，防止精子細胞內成分流失，為精子運動提供能量，降低高度稀釋對精子產生的損傷并起到冷凍保護作用，給精子適應外界環境創造有利條件[6]。從發現甘油可以作為冷凍保護劑之后，畜禽精液冷凍技術的研究和應用工作廣泛開展[7]。由于冷凍過程中帶來的機械損傷，冷凍解凍后的精液仍有部分精子死亡和失去運動能力[8]。因此，冷凍后精子活率和膜結構完整性對解凍復蘇后的受精能力至關重要[9]，所以人們一直在探索有效的稀釋液成分來提高冷凍效率。目前研究報道，Tris 具有良好的滲透性和緩沖性，并且添加適量濃度時對精子毒性較低，冷凍稀釋液中添加Tris 能提高精子活力以及頂體完整率[10]。綿羊的精液具有相對較高代謝水平的特殊性，在有氧環境下可以致使精子氧化導致中毒死亡[11]。葡萄糖、果糖、蔗糖以及乳糖等均可通過提高冷凍復蘇后質膜穩定性保護精子[12-13]。非滲透性保護劑蔗糖可與精子質膜直接發生反應，降低冷凍過程中冰晶對精子造成的損傷[14]。本實驗表明，添加相同濃度的SDS 時，Tris-葡萄糖-檸檬酸鈉冷凍稀釋液冷凍-解凍后精子活率最高，精子畸形率和運動速率也均優于蔗糖-葡糖糖-檸檬酸鈉和OPtidyl 稀釋液組。3 種稀釋液添加1%SDS時，Tris-葡萄糖-檸檬酸鈉組在質膜完整性、頂體完整率和高線粒體膜電位上顯著優于蔗糖-葡糖糖-檸檬酸鈉組，與OPtidyl 稀釋液組沒有顯著差異。造成I 液和II 液效果差異性的原因在于Tris 是滲透性保護劑，使精子能更好地耐受低滲和高滲；而蔗糖是非滲透性，當稀釋液的滲透壓和pH 不穩定時，可能就會造成精子的損傷以及死亡。

3.2 添加SDS 對吐魯番黑羊精液冷凍效果的影響 SDS主要作用是防止低溫對精子的機械損傷，對精子膜結構有保護、修補作用，能夠顯著提高冷凍解凍后精子活率、頂體完整率及質膜完整率[15]。在稀釋液中添加卵黃可以維持稀釋液的膠體滲透壓，保護精子質膜完整性和頂體膜減緩陽離子肽造成的損傷[16]。SDS 與卵黃類脂協同完成對質膜及頂體膜結構的保護，減少頂體內營養物質的滲透和流失[17]。本實驗結果表明，在3 種冷凍稀釋液中添加1%SDS 時，精液冷凍解凍后的精子活率、畸形率和直線運動速率均顯著優于不添加SDS 組和添加2%SDS 組；Tris-葡萄糖-檸檬酸鈉冷凍稀釋液添加1% SDS 組質膜完整性和頂體完整率較2%SDS 組均顯著提高，添加1%SDS 組的高線粒體膜電位精子比率與2%SDS 組沒有顯著差異，但有提高趨勢。SDS 是一種對細胞微毒的陰離子表面活性劑，當添加2%SDS 時，過量的SDS 容易對精子造成損傷，進而降低冷凍效果，所以II 液和III 液中添加2%SDS 解凍后精子活率低于不添加和添加1%SDS 組。綜合各指標，在稀釋液中添加1%SDS 對綿羊精液冷凍效果最佳，這與李新紅等[18]在藍狐冷凍稀釋液中添加SDS 時所得的結果相似。在綿羊凍融精子保護效果方面，SDS 與卵黃之間的劑量存在相關性，二者之間充分混合后具有協同作用。SDS 起的保護作用可能是通過卵黃間接實現的，經過SDS 乳化后的卵黃，分解出卵黃中更多的類脂物，這些類脂物更易進入精子質膜，從而更有效保護凍融精子的膜結構。

4 結 論

本實驗條件下，在Tris-葡萄糖-檸檬酸鈉冷凍稀釋液中添加1% SDS 可以顯著提高吐魯番黑羊的精液冷凍保存效果。