OPS 玻璃化冷凍對小鼠四倍體胚胎體外發育的影響

謝 璐，徐志遠，張 魯，呂文發，劉國世*

（1.吉林農業大學動物科技學院，吉林長春 130118；2.中國農業大學動物科學技術學院，北京 100193）

四倍體胚胎在正常發育過程中只發育為胚外組織（如滋養層、卵黃囊膜、尿囊膜、胎盤等）[1]，而胚胎干細胞（ES 細胞）是具有自我更新和多向分化潛能的胚胎細胞，具有向機體各種組織細胞分化的能力。如果將二者聚合形成嵌合體，其發育能力互相補償，可得到幾乎完全由ES 細胞發育而來的個體，這種技術被稱為四倍體補償技術，又被稱為兩步克隆法[2]。目前，四倍體補償技術在ES 細胞全能型的鑒定、生產轉基因動物上應用十分廣泛，使用基因修飾的ES 細胞產生具有生殖系傳遞能力的嵌合體是新小鼠模型建立的重要方式[3-5]；且四倍體補償技術相比于體細胞核抑制而言，操作簡便、效率高、獲得轉基因動物時間短，在ES 細胞上進行基因編輯也較容易[6-7]。嵌合體為研究細胞譜系和分析突變小鼠的復雜表型及研究胚胎發育機理提供了強有力的工具[8]，因而四倍體胚胎的制備及儲存顯得尤為重要。本研究利用開放式拉長細管（OPS）玻璃化冷凍法對四倍體胚胎進行冷凍，解凍后進行培養，通過觀察囊胚率等對四倍體胚胎發育情況和發育所用時間進行評估，以期在四倍體補償技術中嵌合體制備時提高四倍體胚胎的利用率，便于四倍體胚胎的儲存和運輸。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6 周齡CD-1 母鼠50 只（中國軍事醫學科學院實驗動物中心）于鼠房適應性飼養1 周，自由采食（軍事醫學科學院實驗動物中心生產全價營養顆粒飼料）和飲水。光控周期為08:00—20:00，室內溫度為20～22℃。

1.1.2 實驗試劑 體外操作液M2 液；體外培養液M16液；電融合液：0.3 mol/L 甘露醇溶液；預處理液：10%乙二醇液；解凍液：0.5 mol/L 蔗糖溶液；玻璃化冷凍液：先向7 mL 的mPBS 中添加0.3 g/mL 聚蔗糖和0.5 mol/L 蔗糖，而后加入1.5 mL 乙二醇，搖勻，邊輕搖邊滴入1.5 mL 的二甲基亞砜（DMSO），存于4℃備用。試劑若無特殊說明，均購自Sigma aldrich 公司。

1.1.3 實驗儀器 電融合儀，CO2培養箱，體式顯微鏡，超凈工作臺，熒光正置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 細胞胚胎收集 對20～25 g 的雌性CD-1 小鼠于19:00 注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）10 IU，48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（hCG）10 IU，繼而與雄鼠以1∶1 比例合籠。第2 天08:00 檢查陰道栓，見栓后第2 天19:00 頸部脫臼法處死受孕雌鼠，沖洗輸卵管并收集2-細胞胚。在體式顯微鏡下挑選正常2-細胞置于M2 液中。

1.2.2 電融合法制作四倍體胚胎 將電融合液加入電融合槽內，將2-細胞胚用電融合液洗滌3 次后移入電融合槽的兩電極間。用細玻璃針尖端調整胚體接觸面與電場方向垂直。3 V 交流電排序，調節直流脈沖電壓至50 V。按下脈沖觸發開關2 次，2 次間隔時間為35 μs，處理后用M2 液洗滌胚體2 次，移入M16 液中培養，30～60 min后觀察，棄去未融合胚胎，已融合胚胎繼續培養。

1.2.3 制作OPS 選用0.25 mL 的塑料細管，在酒精燈燒熱后迅速拉伸制成OPS 細管，管壁厚度在0.01～0.02 mm、管壁內徑為0.10～0.20 mm、管壁外徑18～22 mm，用刀片斷開，最終使OPS 細管的長度保持在22～26 mm。

1.2.4 四倍體胚胎的玻璃化冷凍 冷凍前2 h 將室溫調至（25±0.5）℃，將所用溶液在37℃預熱。冷凍時將四倍體胚胎移入預處理液中平衡30 s，再轉入冷凍液中處理25 s。繼而立刻將四倍體胚胎及少量冷凍液吸入OPS 中，標記投入液氮并保存。

1.2.5 四倍體胚胎細胞的解凍 從液氮中取出裝有冷凍四倍體胚胎的OPS 管，迅速浸入放置在37℃恒溫臺體視鏡下的解凍液中，解凍后立即將四倍體胚胎移入新配制的解凍液中平衡5 min。繼而于磷酸緩沖液（PBS 液）中洗滌1 遍，然后將四倍體胚胎移入M16 培養液置于培養箱內恢復1 h，繼續培養。

1.2.6 解凍后四倍體胚胎的觀察 設置3 個實驗組：二倍體胚胎對照組（2N 對照組），即二細胞（2-C）胚胎不進行電激；四倍體胚胎未冷凍組（4N 新鮮組），即2-C 電激1 次后發生融合，四倍體胚胎發育到早期囊胚不進行冷凍；四倍體胚胎冷凍組（4N 冷凍組），即2-C電激1 次后發生融合，四倍體胚胎發育到早期囊胚進行冷凍。分別觀察各組的囊胚數、完全孵化囊胚數，統計囊胚率和孵化囊胚率。分別觀察4N 新鮮組和4N 冷凍組在解凍的四倍體胚胎繼續向囊胚發育的過程，從各組第1 枚早期囊胚出現開始，每隔半小時記錄各組發育至囊胚腔直徑達到三分之二、可滿足后期注射要求的囊胚個數，統計各組完全發育為囊胚腔直徑達到三分之二的囊胚所用時間。

1.2.7 囊胚細胞數染色計數 細胞核熒光標記計囊胚細胞數，將囊胚在含4%多聚甲醛的DPBS 中固定10 min。而后把固定好的囊胚轉移到Hochest 染液中避光染色10 min，再用含0.1% PVA 的PBS 洗3 遍，將囊胚放到載玻片上，臨時封片，蓋上蓋玻片后在熒光正置顯微鏡下觀察細胞數。

1.3 統計分析 采用SPSS 22.0 軟件處理數據，計數資料比較采用單因素方差分析，均值的多重比較采用Duncan′s 進行，結果用平均值±標準誤表示，P＜0.05時為差異顯著。

2 結 果

2.1 OPS 玻璃化冷凍解凍后四倍體胚胎的發育能力 由表1 可見，電融合后4N 新鮮組的囊胚率、孵化囊胚率均與2N 對照組差異不顯著；4N 冷凍組囊胚率與4N 新鮮組差異不顯著，但4N 冷凍組孵化囊胚率較高，顯著高于4N 新鮮組。

2.2 冷凍對四倍體胚胎囊胚細胞數的影響 如圖1 和表2 所示，與2N 新鮮組相比，4N 新鮮組的囊胚細胞數約減半（P＜0.05）。4N 冷凍組的囊胚細胞數與4N 新鮮組無顯著差異。

2.3 冷凍后四倍體胚胎發育至滿足注射要求所需時間如圖2 所示，與4N 新鮮組相比，4N 冷凍組胚胎都發育到適合用于注射囊胚的所需時間較少（P＜0.05），其發育速度相對更快更為集中。

表1 解凍后四倍體胚胎冷凍組和二倍體、四倍體新鮮組的發育情況

圖1 各組囊胚細胞染色代表圖（標尺：100 μm）

表2 解凍后四倍體囊胚和各未冷凍組囊胚的囊胚細胞數

圖2 各組全部發育至囊胚腔直徑達到三分之二的囊胚所用時間

3 討 論

四倍體胚胎的常用制作方法有3 種：一是物理注射法；二是利用化學試劑抑制卵裂球分裂法，一般使用的化學試劑是細胞松弛素 B（Cytochalasin，CB）和秋水仙素等[9]；三是卵裂球融合法，仙臺病毒、化學試劑和電刺激都可使細胞發生融合[10]。電刺激融合法制備四倍體細胞相較其他方法而言，無毒副作用，操作更為簡捷，融合效率更高。因而，本實驗選擇采用電融合法制備四倍體細胞，共有231 枚二細胞參與電融合，融合222 枚，電融合效率為96.1%。融合后的四倍體胚胎后期發育囊胚率和孵化囊胚率與二倍體胚胎相比無明顯差異，電融合法制備四倍體胚胎對胚胎前期的發育無顯著影響。觀察其發育過程，新鮮四倍體胚胎的囊胚細胞數為新鮮二倍體胚胎的一半左右；冷凍后四倍體胚胎的囊胚細胞數與新鮮四倍體差異不顯著，4N 冷凍組和新鮮組僅是囊胚細胞數減半，形態上與二倍體并無區別。

OPS 玻璃化冷凍是目前最常用的一種便捷快速的降溫方式，已廣泛應用于小鼠等哺乳動物的卵母細胞及早期胚胎的冷凍[11-12]，但對小鼠四倍體胚胎的冷凍卻鮮有報道。本實驗用OPS 玻璃化冷凍法對小鼠四倍體胚胎進行冷凍操作，實驗結果顯示冷凍對囊胚率和囊胚細胞數均無顯著影響，可顯著提高四倍體胚胎的孵化囊胚率，說明OPS 玻璃化冷凍并不會降低四倍體胚胎的發育潛能。四倍體胚胎制作成功之后可進行冷凍儲存，實驗中可根據受體鼠數量解凍相應數量的四倍體胚胎，在一定程度上避免浪費，同時節省人力物力。嵌合體胚胎在制作過程中非常繁瑣，用囊胚注射法制作嵌合體胚胎時需要挑選囊胚，只有當囊胚腔直徑達到三分之二后的一段時間內才適合注射。操作過程中會有大部分囊胚由于發育階段不符合要求被放棄，原因是胚胎的發育速度快慢不一，跨度較久。

觀察四倍體胚胎解凍之后培養，這些胚胎均在2～3 h內發育成囊胚腔直徑達到三分之二的階段，與對照組相比發育速度較快、發育階段比較集中。溫度和機械刺激、能量狀態、激素、生長因子、pH 以及抗氧化物等外在因素均能影響胚胎發育速率[13]，冷凍過程會影響胚胎生化活動和新陳代謝速率，冷凍解凍后依然能保持胚胎染色質完整性[14]，可能使胚胎發育中各胚層的發育速率略有調整，最終使得發育速率更為集中。因此，大部分囊胚都能用于注射，減少了四倍體胚胎的浪費，在大量積累了冷凍的四倍體早期囊胚后，可進行連續移植，提高嵌合體胚胎制作時注射和移植的效率。

4 結 論

本實驗通過電融合法制得四倍體胚胎，利用OPS玻璃化冷凍法對四倍體胚胎進行冷凍。解凍后對其發育情況進行觀察發現，OPS 玻璃化冷凍可顯著提高四倍體胚胎的孵化囊胚率，且發育速度更快。冷凍可作為四倍體胚胎儲存、運輸的有效手段，提高嵌合體胚胎制作的效率。