孕烷X受體配體結合結構域蛋白晶體的X線衍射結構解析

馮帆，姜棋予，孫慧偉，王祥喜，申立軍，辛紹杰，李伯安

1.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心 a.臨床檢驗醫(yī)學中心，b.臨床研究管理中心，c.肝臟衰竭診療中心，北京 100039；2.中國科學院 生物物理研究所，北京 100101

目前，病毒性肝炎不僅嚴重危害我國人民的身體健康，也對我國公共衛(wèi)生事業(yè)構成巨大挑戰(zhàn)。Polaris Observatory Collaborators于2018年撰文，系統(tǒng)分析和總結了全球病毒性肝病的最新流行病學數(shù)據(jù)，我國有超過8000萬人攜帶乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）或罹患HBV相關的慢性肝病，這些患者中有相當比例最終會進展為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），因此研究和開發(fā)高效的HCC治療策略具有重要意義[1]。受診療技術的限制，絕大多數(shù)HCC患者初診即為進展期（advanced HCC），目前抗腫瘤藥物治療策略主要是口服以多靶標蛋白激酶抑制劑索拉非尼為代表的分子靶向藥物[2]。盡管目前對進展期HCC進行分子靶向治療能夠延長患者生存期，改善患者生存質量，但仍存在諸多問題。以索拉非尼為例，分子靶向治療的臨床獲益在患者個體間存在較大差異，只有25%～40%的患者對索拉非尼敏感，隨著持續(xù)服用藥物，大多數(shù)一開始對分子靶向藥物敏感的患者會出現(xiàn)耐藥[3]，而瑞戈非尼和樂伐替尼/侖伐替尼等新型分子靶向藥物進入臨床應用的時間較短[4]，隨著臨床診療，也可能會有耐藥等相關報道。

孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）是一種重要的核受體，蛋白結構特征是具有DNA結合結構域（DNA binding domain，DBD）及配體結合結構域（ligand binding domain，LBD）[5]。與雌激素受體等其他類型的核受體不同[6]，PXR不具有配體非依賴的轉錄激活結構域AF-1，僅具有包含在LBD中的配體依賴的轉錄激活結構域AF-2，因此與配體或激動劑結合是PXR轉錄因子活性的重要調節(jié)因素。分子靶向藥物索拉非尼能夠作為配體/激動劑活化PXR進而誘導PXR的各類下游基因（包括各類藥物代謝酶及耐藥蛋白基因等）表達，通過這些代謝相關蛋白加速抗腫瘤藥物自身的代謝與清除等過程，影響其對HCC的治療效果[7-8]。因此，PXR介導的索拉非尼的代謝與清除機制可能是HCC對藥物耐受的根本來源和特異性機制。

前期研究結果顯示，用PXR的激動劑（利福霉素）處理細胞能夠誘導PXR下游耐藥相關基因的表達、加速索拉非尼的代謝與清除作用，最終上調HCC細胞對索拉非尼的耐藥；而使用PXR拮抗劑（酮康唑）處理HCC細胞能夠下調PXR的轉錄因子活性、PXR下游耐藥基因的表達，延緩索拉非尼在HCC細胞中的代謝與清除作用，最終下調HCC細胞對索拉非尼的耐藥，增加HCC細胞對索拉非尼的敏感性[1-2]。這表明，PXR是逆轉HCC分子靶向治療耐藥的干預靶標，研究與開發(fā)PXR的拮抗劑有助于延緩HCC細胞對索拉非尼的代謝與清除作用，實現(xiàn)更為有效的HCC分子靶向治療。本研究旨在利用X線晶體衍射技術，獲得PXR配體結合結構域的三維結構，為研究和開發(fā)靶向PXR的全新藥物奠定堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21（DE3）菌株、pRSFDuet-1表達載體由中國科學院生物物理研究所王祥喜研究員惠賜；PXR-LBD序列的化學合成及表達載體的構建由濟南維真公司完成；DNA聚合酶、限定性內(nèi)切酶等購自NEB公司；PCR、DNA分離純化等試劑盒購自Promega公司；DNA marker、瓊脂糖等試劑購自北京全式金公司；X線衍射儀及數(shù)據(jù)分析工作站由中國科學院生物物理研究所王祥喜研究員提供；PCR儀、DNA電泳槽、紫外采像儀等購自ABI公司。

1.2 基因合成與分子克隆

構建含有PXR-LBD（PXR蛋白130～434氨基酸殘基截短體）的表達載體[9]。首先對基因進行密碼子優(yōu)化后再進行化學合成，獲得PXR-LBD區(qū)域的序列。在化學合成PXR-LBD時，將限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ序列加入PXD-LBD片段兩端，在此基礎上用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切PXRLBD片段及pRSFDuet-1載體，再將PXR-LBD片段與載體按10∶1混合，16℃孵育2 h，4℃孵育過夜，最終獲得含有PXR-LBD序列的pRSFDuet-1載體。對PXR基因序列進行大腸桿菌表達密碼子優(yōu)化后氨基酸殘基序列如下：

1.3 PXR蛋白的原核表達

將插入PXR基因的pRSFDuet-1表達載體轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)菌株，驗證陽性克隆，保菌凍存于-80℃。將表達菌按1∶1000接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基小瓶中，37℃搖床上過夜培養(yǎng)，次日將擴增的小瓶接入LB大瓶進行擴增培養(yǎng)。為了防止蛋白錯誤折疊形成包涵體，待菌體D600nm值達到0.6左右時，將培養(yǎng)溫度降至16℃，并加入0.3 mmol/L IPTG誘導目的蛋白低溫表達，16～20 h后4000 r/min離心40 min收集菌體，棄上清，加入緩沖液［20 mmol/L Tris（pH7.8），100 mmol/L NaCl，5%甘油］重懸菌體，凍存于-80℃。用超聲波破碎儀充分破碎大腸桿菌菌體，16 000 r/min離心40 min收集上清。

1.4 PXR蛋白的分離純化

由于表達的PXR蛋白具有載體自帶的組氨酸標簽，故可通過Ni-NTA親和層析的方法對目的蛋白進行純化。將Ni-NTA親和層析柱灌入10倍柱體積左右的純化緩沖液［20 mmmol/L Tris（pH7.8），100 mmmol/L NaCl，5%甘油］進行平衡，用恒流泵將破菌后的離心上清加入Ni-NTA親和層析柱，反復通過Ni-NTA親和層析柱3次，使PXR蛋白充分結合Ni-NTA介質。Ni-NTA親和層析柱結合結束后，加入純化緩沖液沖掉剩余未結合的蛋白，繼續(xù)用洗雜緩沖液［20 mmmol/L Tris（pH7.8），100 mmmol/L NaCl，5%甘油，20 mmmol/L咪唑］沖洗柱子，可將大部分非特異性結合的雜蛋白洗掉。洗去雜蛋白后，加入含有高濃度咪唑的洗脫緩沖液［20 mmmol/L Tris（pH7.8），100 mmmol/L NaCl，5%甘油，250 mmmol/L咪唑］可將目的蛋白從親和柱洗脫。為了進一步提高蛋白純度，繼續(xù)使用凝膠排阻層析技術對蛋白進一步純化。將分子篩Superdex75用純化緩沖液［20 mmmol/L Tris（pH7.8），100 mmmol/L NaCl，5%甘油］平衡，用30kD超濾管對洗脫緩沖液洗脫的目的蛋白進行濃縮，將濃縮后的樣品（約500 μL）上樣Superdex75層析柱，對蛋白峰進行分管收集，再進行質譜檢測，確定蛋白表達是否正確。

1.5 PXR蛋白結晶與結構解析

用30kD濃縮管將分子篩純化后的PXR蛋白濃縮至5 mg/mL，用Hampton等公司的晶體篩選試劑盒對蛋白進行結晶條件篩選與優(yōu)化。采用懸滴法，于20℃恒溫恒濕環(huán)境下初步篩選到PXR蛋白結晶條件，在此基礎上進行pH、鹽濃度、沉淀劑濃度等的條件優(yōu)化。優(yōu)化后的晶體生長條件為80 mmmol/L咪唑（pH7.5）、100 mmmol/L Na-Cl、10%異丙醇，最終確定獲得高質量的PXR蛋白晶體。以甘油作為防凍劑，在上海同步輻射光源收集晶體衍射數(shù)據(jù)，參考PDB 1NRL的研究作為初始模型，采用CCP4程序包中的Phaser軟件，利用分子置換方法解析該蛋白質晶體的結構，最后用Phenix.refine軟件和COOT軟件對結構進行修正，確證所得蛋白三維結構數(shù)據(jù)的分辨率，并保證各項指標均在合理范圍內(nèi)。

2 結果

2.1 PXR蛋白的分離純化

首先構建了PXR-LBD的表達載體（圖1A），其中載體條帶約為3000 bp，目標基因條帶（PXR-LBD）為750～1000 bp。在此基礎上對親和層析結果進行SDS-PAGE分析，在含250 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液的洗脫樣品中有大量目的蛋白（圖1B）。凝膠排阻層析結果顯示目的蛋白性質均一，根據(jù)出峰位置判斷蛋白應為單體形式存在，無聚集形式的蛋白（圖2）。在此基礎上，對分子篩吸收峰對應管號為3～11的樣品進行SDSPAGE分析，結果顯示樣品5～9管為純度較高、均一的PXR目的蛋白（圖3）。切割SDS-PAGE凝膠對上述蛋白條帶進行質譜鑒定，結果顯示最終純化獲得的蛋白即為目的蛋白PXR，且匹配的肽段顯示PXR蛋白無降解現(xiàn)象（圖4）。

圖1 PXR-LBD表達載體的鑒定及PXR-LBD蛋白Ni-NTA親和層析SDS-PAGE分析

圖2 PXR-LBD蛋白Superdex75分子篩純化結果

圖3 PXR-LBD蛋白經(jīng)Superdex75純化后的SDS-PAGE分析

圖4 純化的PXR-LBD蛋白SDS-PAGE條帶的質譜鑒定結果

2.2 PXR蛋白晶體三維結構的X線衍射解析

采用懸滴法，于20℃恒溫恒濕環(huán)境下得到PXR-LBD晶體（圖5A、B）。對初步篩選到的結晶條件進行pH、鹽濃度、沉淀劑濃度等條件優(yōu)化，最終獲得能夠進行X線衍射數(shù)據(jù)收集的高質量蛋白晶體（圖5C、D）。所得PXR-LBD蛋白晶體形狀規(guī)則，質量較高。在此技術上對PXR蛋白晶體進行結構解析，結果如圖6，所得蛋白晶體X線衍射的分辨率可達2.8 ?。進一步用HKL2000軟件包對收集的衍射數(shù)據(jù)進行處理，經(jīng)過指標化、積分和scale，最后確定晶體空間群為P212121。圖7為PXR蛋白LBD區(qū)域平視和俯視視角的帶-環(huán)（band-loop）結構圖，顯示出PXR-LBD的8個α螺旋結構與相應轉角（loop）。圖8為PXR-LBD的電子密度圖，顯示LBD蛋白肽鏈骨架和電子密度。

圖5 PXR-LBD蛋白結晶結果

圖6 PXR-LBD蛋白晶體X線衍射圖

圖7 解析的PXR-LBD蛋白晶體整體結構

圖8 PXR-LBD晶體結構中配體結合袋（ligand-binding pocket）附近的電子密度（1.5σ）

3 討論

PXR是重要的核受體，最初僅被認為是類固醇激素受體[7]。隨著研究的拓展，多種內(nèi)/外源藥物/毒物都可作為PXR的配體/激動劑，這些藥物或毒物能夠活化PXR，誘導代謝酶及藥物轉運體的表達[7]。活化的PXR與維甲酸X受體形成異源二聚體從細胞質遷移進入細胞核，與其下游基因啟動子區(qū)/增強子區(qū)所包含的PXR結合元件結合，最終介導其下游基因的轉錄[7]。PXR的下游基因種類多樣、作用廣泛，主要包括多藥耐藥基因-1和乳腺癌耐藥蛋白等各類耐藥蛋白（即藥物Ⅲ相代謝酶/藥物轉運體）、CYP 3A4等多種亞型的細胞色素氧化酶（即藥物Ⅰ相代謝酶/藥物氧化代謝酶）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶等基團轉移酶（即藥物Ⅱ相代謝酶/基團轉移酶）[7]。各種抗腫瘤藥物能夠對HCC細胞造成嚴重損傷，因此抗腫瘤藥物既是外源性藥物，又是外源性毒物。PXR作為肝臟對外源性藥物和毒物代謝與解毒機制的調控樞紐，各種抗腫瘤藥物有可能作為配體/激動劑活化PXR，進而誘導PXR的各類下游基因（包括各類藥物代謝酶及耐藥蛋白等）表達，最終通過這些代謝相關蛋白加速抗腫瘤藥物的代謝與清除等過程，最終影響HCC的治療效果。由于肝臟是人體代謝的中心，而HCC細胞具有更為旺盛的物質攝取和代謝特性，因此PXR介導的抗腫瘤藥物的代謝與清除機制可能是HCC對抗腫瘤藥物多藥耐藥的根本來源和特異性機制。這表明，研究和開發(fā)PXR的拮抗劑具有重要意義。但現(xiàn)有藥物研究存在較大不足，體現(xiàn)在：以利福平為代表的多種藥物被確認為PXR的激動劑或明確其具有誘導PXR轉錄的作用，但關于PXR拮抗劑的報道極少，僅酮康唑一種藥物被用作PXR的拮抗劑；現(xiàn)有研究主要關注PXR的藥代動力學、藥物相互作用，其作為抗腫瘤干預靶標的研究極少；目前未有依據(jù)PXR設計小分子化合物拮抗劑的研究報道，而獲得PXR的高分辨率三維結構數(shù)據(jù)是設計與研發(fā)PXR特異性拮抗劑的基礎。我們解析了PXR-LBD的晶體結構，不僅有助于PXR相關研究，也為基于PXR三維結構的藥物設計與研發(fā)奠定了堅實基礎。