自由基聚合反應修飾的金納米粒子用于高靈敏度免疫傳感器研究

徐力紅,林虹君,李高偉，趙飛，尉馳

中國人民解放軍32311部隊，北京 102112

對臨床生物標志物的靈敏、準確檢測是早期疾病診斷面臨的一大挑戰[1-2]。隨著對早期生物標志物超靈敏檢測的需求日益增加，研究人員更加關注如何創新檢測技術或信號放大方法來提高檢測靈敏度。對于臨床應用，免疫傳感器必須是簡單、廉價和超靈敏的，并能用于檢測患者樣本中微量生物標志物[3-5]。但由于現有傳感器操作復雜、成本高昂、耗時較長，因此其應用受到了較大限制。為了克服這些問題，人們越來越重視開發新的分析方法來測定超低濃度的分析物和實際樣品[6-9]。

金納米粒子（gold nanoparticles，GNps）作為經典的納米載體，具有粒徑可控、制備簡單、導電性好等優點。此外，GNps在不破壞待測物生物活性的前提下，易與蛋白質結合[10-13]。自由基聚合反應作為一種理想的接枝策略，可以在很多載體表面生成非交聯、線性聚合物鏈，該方法最大的優點是聚合物的厚度具有高可控性[14-19]。

在本研究中，我們將辣根過氧化物酶和抗體按照高比例結合，研發出一種新型的由原子轉移自由基聚合物（atom transfer radicalpolymer，ATRP）修飾的GNps免疫傳感器，用于檢測高敏感的生物標志物。由于毛發狀的聚合物鏈為蛋白質提供了大量的活性固定位點，所以該方法具有極高的靈敏度[20-23]。

1 材料與方法

1.1 材料

促腎上腺皮質激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）樣本、辣根過氧化物酶標記的二抗（HRP-Ab2）均購自Abcam公司；牛血清白蛋白（BSA）、1-乙基-3-（3-二甲基氨）-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）均購自Sigma-Aldrich公司；氯金酸（HAuCl4·4H2O）為南京市威圣化工貿易有限公司產品；檸檬酸鈉為上海創順化工有限公司產品；KH2PO4、Na2HPO4、KCl、Tween-20 均購自北京化學試劑公司；實驗用水為二次蒸餾水。

Milli-Q型純水儀（≥18 MΩ，Millipore公司）；Tecnai G2 20透射電鏡（FEI香港有限公司）；85-2數顯型恒溫攪拌器（國瑞試驗儀器廠）；Sorvsll Legend Micro 17離心機（Thermo公司）。

1.2 GNps和引發劑的制備

本研究中GNps按照經典方法制備。

引發劑制備步驟：將11-巰基-1-十一醇溶解于四氫呋喃中，幾分鐘后加入吡啶，然后通入氮氣，將混合物冰浴30 min，最后加入2-溴-異丁基溴，繼續攪拌，4 h后將反應液過濾、干燥，即得到引發劑，儲存與4℃待用。GNps的透射電鏡圖像如圖1所示。

圖1 GNps的透射電鏡圖

1.3 ATRP修飾GNps

將GNps放入EP管中，在旋轉儀上振搖約12 h，用甲醇洗滌3次，加入葡萄糖和引發劑，攪拌、過夜，即得到GNps-ATRP[24-26]。GNps-ATRP的透射電鏡圖像如圖2所示。

圖2 GNps-ATRP的透射電鏡圖

1.4 GNps-ATRP-（Ab2+HRPs）的制備

首先，將乙二胺加到GNps溶液中，將混合液置于80℃；其次，將含戊二醛的PBS溶液加到以上溶液中，在GNps表面即得到醛基；第三步，將氰化鈉加入Ab2和用PBS溶液制備的HRPs溶液中，在Tris-HCl緩沖液中反應24 h，將反應液放置于PBS溶液中，4℃過夜；最后，用Tris-HCl緩沖液洗滌3次，即得GNps-ATRP-（Ab2+HRPs）。制作過程示意圖見圖3。

2 結果與討論

2.1 新方法評價

以CRH為模型分析物，對新方法的性能進行考察。CRH是參與應激反應的小分子肽激素和神經遞質，主要由哺乳動物腦組織下丘腦室旁核神經元合成和分泌。高CRH水平與急性高原反應（acute mountain sickness，AMS）的發生直接相關[27]，血漿中CRH水平的高低對預測AMS的發生具有重要的參考意義。因此，該數值可以指導將要去高空旅行或工作的人員采取必要的預防措施，使危害降到最低。由于血液檢測較為復雜，且血液中干擾因素太多，對檢測的準確性有較大影響，所以我們采取對唾液中的CRH進行測量。眾所周知，唾液樣本容易獲得，且含有較少的干擾物。但唾液中CRH的含量明顯低于血漿中CRH的含量，因此，提高免疫傳感器的靈敏度就是檢測的關鍵所在。

首先，將受試者唾液中的CRH按不同比例稀釋，分別用傳統的免疫傳感器和新改良的免疫傳感器檢測。然后，將制備好的樣品和2種不同的復合物Ab2-HRPs和GNps-ATRP-（Ab2-HRPs）孵育后，測量2種免疫傳感器的電流響應。接下來，對影響免疫傳感器性能的條件進行優化，并進行選擇性和干擾性考察，最后利用新型免疫傳感器對人唾液樣本進行評價。

圖3 免疫傳感器原理圖

采用傳統方法和新建立方法檢測相同濃度梯度的CRH樣本，分別繪制工作曲線。傳統方法的線性范圍為1～300 pg/mL，檢測限為1 pg/mL（圖4）；新方法的檢測線性范圍為0.5～250 fg/mL，檢出限為0.5 fg/mL（圖5）。因此，由于引入了ATRP修飾的GNps，使得與Ab2結合的HRP大量增加，從而實現了超高的檢測靈敏度。為了考察新方法的可重復性，進行了3次獨立性實驗，結果表明改進后的方法具有較高的重現性。

圖4 Ab2-HRPs用于傳統免疫傳感器檢測反應

圖5 GNps-ATRP-（Ab2-HRPs）用于新的免疫傳感器檢測反應

2.2 結論

通過引入ATRP修飾的GNps進行目標蛋白質檢測，研制出一種可重復、超靈敏、穩定的新型免疫傳感器。新方法的檢測限為0.5 fg/mL，是傳統免疫傳感器方法的2000倍。新的檢測策略有望推廣到治療監測和臨床疾病篩查領域。改進后的免疫傳感器為納米材料在免疫傳感中的應用開辟了新的途徑，在未來的臨床試驗或藥物篩選中具有廣闊的應用前景。