淫羊藿苷對體外牙周膜細胞增殖、成骨分化以及成骨和破骨因子表達的影響

李雪，朱勇，王丹楊，張耀超

西安醫學院 口腔醫學院，陜西 西安 710021

牙周炎是一種局部牙周組織慢性炎癥性疾病，主要臨床表現為牙齦炎癥、出血、牙槽骨吸收、牙齒松動移位，嚴重者出現牙齒的自行脫落。牙周組織的重建和修復是長期以來口腔醫生廣泛關注的臨床重點和難點話題[1]。牙周膜細胞作為牙周組織中最主要的細胞群，由成纖維細胞、成骨細胞、上皮細胞和間充質細胞等成分組成。牙周膜細胞具有向成骨和成牙骨分化的潛能，參與調節牙槽骨再生，因此被認為是牙周疾病組織工程研究的重要種子細胞[2]。淫羊藿苷是一種小檗科淫羊藿屬植物，長期以來被用作補腎壯陽、抑菌消炎、抗衰老等用途[3-4]。近年來，淫羊藿苷也被證實能夠顯著抑制骨質疏松的發生和發展，對抗機體的骨衰退進程，并且能夠顯著加速局部的骨折和骨缺損修復[5-7]。但是，淫羊藿苷對于牙周膜細胞的生物學活性以及成骨分化潛能的影響尚未被系統闡明。本研究旨在通過體外分離培養人原代牙周膜細胞，探索淫羊藿苷對于人牙周膜細胞增殖、分化以及成骨和破骨因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

淫羊藿苷、胰蛋白酶購于Sigma公司；胎牛血清、α-MEM細胞培養基、青/鏈霉素雙抗、無菌PBS購于Gibco公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒、堿性磷酸酶活性檢測試劑盒、RIPA裂解液購于碧云天生物技術公司；TRIzol購于Invitrogen公司；cDNA反轉錄試劑盒購于天根生物技術公司；BCA蛋白定量試劑盒購于Pierce Chemical公司；OCN（骨鈣素）、Runx2（Runt相關轉錄因子2）、BMP2（骨形態發生蛋白2）、RANKL（核因子κB受體活化因子配體）抗體購于Abcam公司；辣根過氧化物酶標記二抗購于Bioworld公司；多功能酶標儀（Infinite M200）購于TECAN公司；紫外分光光度計（SmartSpec Plus）、PCR 儀（T100 thermal cycler）、半干轉膜儀（Trans-Blot SD System）、凝膠成像系統（Bio-Rad Gel Doc XR+）購于Bio-Rad公司；倒置顯微鏡（LEICA DM LA）購于Leica公司；細胞培養箱（Thermo 3110）購于Thermo公司；低溫高速離心機（Sigma 3-18K）購于Sigma公司。

1.2 人牙周膜細胞的體外分離與培養

選取因正畸治療而需要拔除健康前磨牙的12～16歲青少年患者（無炎癥和齲齒），將其拔除的前磨牙進行原代牙周膜細胞的體外分離。將拔除的牙齒（＞20顆）立即浸沒于含青/鏈霉素雙抗的α-MEM培養基中，反復漂洗后，刮取牙根中1/3的牙周膜組織，用無菌眼科剪將組織剪碎成約0.5 mm×0.5 mm大小的組織塊，以陣列的形式均勻排布于培養瓶底部，在培養瓶中加入含10%青/鏈霉素、10%胎牛血清的α-MEM細胞培養基，倒置培養瓶，置于培養箱中12 h，隨后翻轉培養瓶繼續培養，隔天換液。生長至第3～5代的細胞用于實驗。

1.3 淫羊藿苷干預與實驗分組

取第3～5代的原代牙周膜細胞，在傳代培養的12 h后進行淫羊藿苷干預。整個實驗分為實驗組和對照組。實驗組細胞加入0.01 mg/L淫羊藿苷溶液，對照組加入單純成骨培養基。分別對細胞進行MTT細胞增殖檢測、堿性磷酸酶活性檢測，以及OCN、Runx2、BMP2和RANKL的基因和蛋白表達檢測。

1.4 基于MTT法的細胞增殖檢測

選取生長狀態良好的牙周膜細胞制成濃度為1×105/mL的細胞懸液，以每孔100 μL將細胞懸液接種于96孔板中，檢測前吸棄96孔板中的細胞培養基，用無菌PBS反復沖洗3～5次，隨后在96孔板的每孔內加入10 μL 5 mg/mL的MTT溶液，于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育4 h，隨后在96孔板的各孔內加入200 μL DMSO，37℃振蕩孵育15 min，用Infinite M200 Pro酶標儀測定每孔樣本的值。通過下式計算細胞抑制率：

1.5 堿性磷酸酶的檢測分析

用無鈣和鎂的Hanks液清洗細胞，胰酶消化后收集細胞，加入0.2%的Nonidet P-40重懸浮細胞，冰浴中超聲波裂解2 min，隨后用堿性磷酸酶活性測定試劑盒檢測牙周膜細胞中堿性磷酸酶的表達含量。

1.6 成骨和破骨因子的基因表達檢測

在牙周膜細胞中加入異硫氰酸胍裂解細胞，用異硫氰酸胍-酚氯仿法提取總RNA，再用Super-ScriptⅢ反轉錄酶將提取的RNA合成為cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix進行real-time PCR測定選取的基因，包括OCN、Runx2、BMP2、RANKL及GAPDH（引物序列見表1）。每個樣本上樣至96孔板的3個復孔中，用2-ΔΔCt法進行目的基因的定量分析，使用內參基因β-actin對所有目的基因進行標準化處理。每個樣本均重復3次real-time PCR，獲得并計算其平均值。

表1 用于本研究的real-time PCR引物序列

1.7 成骨和破骨因子的蛋白表達檢測

在牙周膜細胞中加入200 μL RIPA裂解液，待完全裂解后轉移至4℃離心30 min。用蛋白定量試劑盒對提取的總蛋白進行定量。蛋白經煮沸變性處理后進行電泳實驗。配制10%的下層Tris-甘氨酸-SDS分離膠和5%的上層壓縮膠，加入新鮮的電泳緩沖液，按照每孔40 μg蛋白提取物上樣，在30 mA恒流條件下電泳。根據marker蛋白的相對分子質量將目的蛋白條帶剪切，按照目的蛋白相對分子質量計算所需轉膜時間（轉膜電壓20 V）。轉膜畢，進行麗春紅染色以評估電泳和轉膜效果。隨后，將PVDF膜封閉于含5%BSA的Tris鹽溶液中1 h，與特定蛋白一抗的TBST溶液（含5%BSA）混合孵育4℃過夜，包括OCN、Runx2、BMP2、RANKL及β-tubulin。用TBST溶液洗滌3次后，將PVDF膜與1∶3000的HRP-conjugated二抗在室溫下孵育1 h，用ECL化學發光系統直接對目標蛋白水平進行檢測分析。用QuantityOne對蛋白的Western印跡結果進行半定量分析，檢測蛋白表達水平。

1.8 統計學分析

本研究中所有實驗數據均采用x±s表示。用Windows版本的SPSS 20.0統計學分析軟件對實驗數據進行統計分析比較。對照組和藥物組細胞的各參數指標的統計學差異均采用t檢驗進行分析，以P＜0.05作為有顯著統計學差異的標準。

2 結果

2.1 淫羊藿苷對人牙周膜細胞體外增殖速率的影響

通過MTT檢測評估淫羊藿苷對人牙周膜細胞體外增殖速率的影響，結果如圖1。加入淫羊藿苷的第3 d，實驗組細胞的增殖速率較對照組提高了 36.8%（P＜0.05）；第5 d，實驗組細胞的增殖速率同樣顯著高于對照組（P＜0.05），相比對照組提高了33.3%。結果提示淫羊藿苷干預能夠顯著提高體外人牙周膜細胞的增殖速率。

圖1 MTT檢測淫羊藿苷對人牙周膜細胞體外增殖速率的影響

2.2 淫羊藿苷對體外人牙周膜細胞堿性磷酸酶活性的影響

用堿性磷酸酶試劑盒檢測評估淫羊藿苷對人牙周膜細胞體外分化速率的影響，結果如圖2。在淫羊藿苷干預的第3 d，實驗組的堿性磷酸酶活性顯著高于對照組（P＜0.05），較對照組增加了45.2%；第5 d，實驗組的堿性磷酸酶活性同樣顯著高于對照組（P＜0.05），較對照組增加了33.7%。結果提示，淫羊藿苷干預能夠顯著促進人牙周膜細胞的體外成骨分化潛能。

圖2 堿性磷酸酶檢測試劑盒評估淫羊藿苷對人牙周膜細胞體外成骨分化速率的影響

2.3 淫羊藿苷對人牙周膜細胞OCN、Runx2、BMP2和RANKL基因表達的影響

圖3 Real-time PCR檢測淫羊藿苷對體外人牙周膜細胞中OCN、Runx2、BMP2和RANKL基因表達的影響

通過real-time PCR檢測評估淫羊藿苷對體外人牙周膜細胞中OCN、Runx2、BMP2和RANKL基因表達的影響，結果如圖3。加入淫羊藿苷的實驗組中人牙周膜細胞成骨相關的OCN、Runx2、BMP2基因表達水平均顯著高于對照組（P＜0.05），表達水平分別增加了250.4%、321.6%、552.3%；同時，實驗組中人牙周膜細胞的破骨相關RANKL基因表達顯著低于對照組（P＜0.05），相比對照組降低了75.3%。結果揭示，淫羊藿苷干預能夠顯著上調人牙周膜細胞的體外成骨相關因子OCN、Runx2、BMP2的基因表達，并顯著下調破骨相關因子RANKL的基因表達。

2.4 淫羊藿苷對人牙周膜細胞OCN、Runx2、BMP2和RANKL蛋白表達的影響

通過Western印跡檢測評估淫羊藿苷對體外人牙周膜細胞中OCN、Runx2、BMP2和RANKL蛋白表達的影響，結果如圖4。在淫羊藿苷作用下，人牙周膜細胞中的成骨相關因子（OCN、Runx2和BMP2）的蛋白表達水平相比對照組分別增加了110.3%、191.4%、262.0%，均具有統計學差異（P＜0.05）；實驗組人牙周膜細胞破骨相關RANKL蛋白表達水平顯著低于對照組（P＜0.05），相比對照組降低了47.1%。以上結果表明淫羊藿苷能夠顯著增加人牙周膜細胞的體外成骨相關因子OCN、Runx2、BMP2的蛋白表達，并抑制破骨相關因子RANKL的蛋白表達。

圖4 Western印跡檢測淫羊藿苷對體外人牙周膜細胞中OCN、Runx2、BMP2和RANKL蛋白表達的影響

3 討論

我國中醫藥資源豐富，歷史悠久，且中藥具有毒副作用小、取材廣泛、藥效明顯的特點。小檗科草本植物淫羊藿是傳統的補腎中藥。《本草綱目》記載，淫羊藿具有“益精氣、堅筋骨、實腰膝、強心力”之功效。現代藥理研究表明，淫羊藿屬植物的化學成分主要為黃酮、木脂素、生物堿和多糖，此外還有揮發油、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻酸等。黃酮類化合物為淫羊藿的主要有效成分，而淫羊藿苷是淫羊藿的主要黃酮類成分，是淫羊藿及其制劑質量控制的主要指標。淫羊藿苷具有免疫調節、補腎壯陽、抗腫瘤、抗菌消炎多種生物藥理作用[8-9]。

十余年來，淫羊藿苷對于骨代謝和骨質疏松的作用效果得到了學者們的廣泛關注。研究發現，淫羊藿苷能夠顯著抑制骨質疏松動物的骨丟失進程，并顯著改善骨質疏松動物的骨質量[10]。而淫羊藿苷對于加速骨損傷修復和骨不連的延遲愈合的積極效應也有一些文獻報道[11-12]。體外實驗發現，淫羊藿苷可以顯著促進體外骨髓基質細胞的成骨性分化和成骨細胞的分化成熟[13-14]。同時，也發現淫羊藿苷能夠促進成骨細胞的增殖、成熟、成骨分化和新骨礦化基質形成能力[15]。并且，淫羊藿苷也被證實能夠顯著抑制破骨細胞的形成和骨吸收活性[16]。但是，淫羊藿苷對于牙周膜細胞活性和分化潛能的調控作用及機制目前尚未被系統闡明。

牙周膜細胞作為牙周組織中最多且最重要的細胞群，在牙周組織的損傷修復與再生中發揮至關重要的作用。尤其對于牙周炎患者，牙周膜組織的結構退化和牙周膜細胞的活性功能損傷是誘發其牙齒功能損傷的重要因素。而牙周膜細胞群也被認為是牙周組織工程研究的最重要種子細胞類型之一。本研究的MTT結果揭示，我們的原代細胞經過淫羊藿苷干預后表現出更高的增殖速率。淫羊藿苷顯著增加了人牙周膜細胞的細胞數量，而細胞群數量的增加不僅在一定程度上反映了細胞活性的促進效應，并且對于牙周膜細胞趨向成骨細胞的定向分化的促進具有積極效應。堿性磷酸酶是由骨質中成骨細胞分泌的，反映骨質中鈣鹽水平和機體鈣吸收能力的酶類，其活性反映成骨細胞的活性和功能狀況，并能夠代表成骨分化的趨勢[17]。我們的研究揭示3、5 d的淫羊藿苷干預均能顯著提高牙周膜細胞的堿性磷酸酶表達水平。表明淫羊藿苷能夠顯著促進牙周膜細胞向成骨細胞的定向分化潛能，并提升其中成骨細胞的細胞活性和功能狀況。

OCN主要由成骨細胞合成并分泌，在機體骨鈣代謝中發揮關鍵作用，能夠反映成骨細胞的成熟、分化和成骨能力[18]。Runx2作為骨組織中最重要的轉錄調控因子，在成骨細胞產生和成熟中發揮重要的調節作用[19]。BMP2是一種具有強誘導成骨分化能力的信號分子，也被認為是成骨細胞活性和功能的重要標志物[20]。我們的realtime PCR和Western印跡結果均揭示，淫羊藿苷干預后牙周膜細胞的OCN、Runx2和BMP2基因和蛋白表達水平均顯著性增加。這進一步證明淫羊藿苷能夠顯著促進牙周膜細胞向成骨細胞的定向分化能力，并促進成骨細胞的成熟和新骨形成功能。

RANKL是一種促進破骨細胞形成和成熟的調控因子，主要與破骨細胞膜上的RANK結合啟動破骨細胞胞內的信號轉導通路。RANKL是反映骨組織中破骨細胞活性和骨吸收功能的細胞因子[21]。我們的研究發現，淫羊藿苷作用后，體外牙周膜細胞中的RANKL表達水平顯著降低。這一結果提示淫羊藿苷作用后牙周膜細胞中的噬骨（骨吸收）能力被顯著減弱，進一步證實了淫羊藿苷對于骨合成和分解代謝的雙向調節作用。

綜上所述，本研究表明淫羊藿苷能夠顯著促進體外人牙周膜細胞的增殖和定向成骨分化潛能，并能夠上調成骨相關的OCN、Runx2和BMP2的基因和蛋白表達，顯著抑制破骨相關的RANKL的基因和蛋白表達。本研究不僅可為牙周炎的藥物治療提供實驗依據，也能為基于組織工程技術的牙槽骨和牙周組織的損傷修復再生提供新思路。