蘇氨酸醛縮酶的研究進展

黎軍，張志雄，楊金亮，李學英

1.遵義醫(yī)科大學 醫(yī)學遺傳學教研室，貴州 遵義 563000；2.四川大學 生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610000

蘇氨酸醛縮酶（threonine aldolases，TAs）主要存在于微生物和植物中[1-9]，以磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）為輔酶，在生理條件下催化蘇氨酸裂解為甘氨酸和乙醛，承擔蘇氨酸分解代謝和甘氨酸合成的功能[8]。在體外，TAs可以催化不同類型的醛與α-氨基酸發(fā)生醇醛縮合反應，生成具有2個手性中心的β-羥基-α-氨基酸[10-13]，而后者為一類存在于氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、腎上腺素、屈昔多巴、萬古霉素、鞘脂菌素等許多活性醫(yī)藥物成分（active pharmaceutical ingredient，API）中的核心片段[14-19]。因此，TAs在生物合成中具有重要的應用價值。TAs在催化過程中可以嚴格控制產(chǎn)物α-碳位的立體構型（e.e.＞99%），而對β-碳位的立體構型控制相對較弱，產(chǎn)物常為一對非對映異構體[7-12]。在生物合成中如何控制產(chǎn)物βC位的立體構型，以及酶催化過程的分子機制，是近年來研究TAs的熱點。

1 TAs的分類

根據(jù)其對立體異構的蘇氨酸的活性的不同，可將TAs分為L-TAs和D-TAs這2大類。L-TAs可以進一步分為特異性裂解L-蘇氨酸的L-TA（EC4.1.2.5）、特異性裂解L-別-蘇氨酸的L-allo-TA（EC4.1.2.49）、同時對L-蘇氨酸和L-別-蘇氨酸均具有裂解活性的低選擇性L-low-TA（EC4.1.2.48）等3個類型。D-TAs中，目前僅發(fā)現(xiàn)低特異性的 D-TA（EC4.1.2.42）[8,14]。L-TAs和 DTAs發(fā)揮作用必須依賴于輔酶PLP，PLP是維生素B6的活性形式。序列相似性和系統(tǒng)發(fā)生分析表明L-TAs和D-TAs基因是2個相互獨立進化的基因家族。L-TAs屬于天冬氨酸氨基轉移酶超家族，為PLP依賴的Ⅰ型折疊酶；D-TAs屬于丙氨酸消旋酶超家族，為PLP依賴的Ⅲ型折疊酶[8]。

2 TAs的結構

幾個種屬來源的L-TA、L-low-TA、L-allo-TA、D-TA的晶體結構已解析（表1），為理解TAs的分子催化機制奠定了基礎。

表1 TAs的晶體結構列表

2.1 L-TAs的結構

L-TAs為222對稱的同源四聚體，每個單體包含1個大的結構域和1個小的結構域，整體二級結構相似度很高（圖1）[21-24]。L-TAs單體大結構域為α/β/α三明治折疊模式，共包含7個β折疊，大結構域位于四聚體中間位置，PLP的醛基共價結合于大結構域的特定賴氨酸殘基；L-TAs的小結構域通常由2～4個β折疊和α螺旋構成，位于四聚體的外圍。2個單體緊密接觸形成催化二聚體，活性位點位于2個單體緊密接觸的界面處，每個催化二聚體含有2個活性中心，共有4個活性中心。L-TAs的活性中心具有極其相似的保守氨基酸殘基和高度相似的空間結構，PLP的功能基團與這些保守的氨基酸殘基形成特定的相互作用（圖1C）。

L-TAe（大腸桿菌）的活性中心，PLP與Lys197共價結合形成內部醛亞胺，但在pH5.6條件下PLP與Lys197無法形成內部醛亞胺[22]。PLP的吡啶環(huán)與His83的咪唑環(huán)形成π堆疊，與Ala168形成疏水接觸；吡啶環(huán)的氮原子與Asp166的羧基形成氫鍵相互作用，酚羥基與Arg169的胍基形成氫鍵相互作用，磷酸基團直接與Arg229的胍基相互作用。活性中心含有2個重要的水分子，一個水分子與PLP的磷酸基團，Ser196、Ser205的羥基，Gly204的酰胺氧形成氫鍵相互作用；另外一個水分子介導了PLP磷酸基團與Gly227和Lys222形成氫鍵相互作用[21]。L-TAe可結合6個鎂離子或鈣離子，其中4個二價陽離子距離活性中心9 ?，另外2個位于四聚體對稱中心。

L-TAaj（簡氏氣單胞菌 DK-39）的 Arg171、Arg313、Ser8的側鏈與醛亞胺相互作用，將底物錨定到活性位點，His85的咪唑環(huán)與PLP-GLY的吡啶環(huán)形成π堆疊，并且可參與調節(jié)蘇氨酸醛縮酶的立體特異性。配體Gly的氨基略微偏離PLPGly的吡啶環(huán)平面，使其易斷裂的外部醛亞胺鍵垂直于PLP-Gly的吡啶環(huán)平面。His128的側鏈可與底物L-allo-Thr上的羥基形成氫鍵，當His128突變?yōu)門yr時，殘基的側鏈從活性位點移出4.2 ?。與野生型酶相比，L-Taj的H128Y/S292R突變體對L-allo-Thr的活性提高了3倍，對LThr的活性提高了322倍。

圖1 L-TAs的二級結構與活性中心

L-TAtm（海棲熱袍菌）與L-TAaj具有相似的整體結構，用DALI服務器（Holm&Sander，1995）進行結構比較，L-TAaj與L-TAtm的晶體結構有49%的一致性（Z-score 47.9；r.m.s.d.1.2 ?）[23]。L-TAtm含有鈣離子和鈉離子，鈣離子位于每個單體的大小結構域之間，四聚體包含6個鈣離子，有2個位于四聚體對稱中心，每個鈣離子通常含有1到2個水分子；鈉離子位于Arg72，含有2個水分子。金屬離子可能具有穩(wěn)定四聚體的作用。

2.2 D-TA的結構

D-TAax（木糖氧化產(chǎn)堿菌）為同源二聚體，2個單體頭尾相連，接觸面共同組成2個活性中心（圖2）[25]。每個單體含有2個結構域，大的結構域由8條α/β-桶狀結構組成的丙氨酸消旋酶樣結構域（32～274殘基），小結構域由N端（1～31殘基）和C端（275～379殘基）組成的β-結構域構成。β-結構域包含5個反相平行的β鏈組成的β桶裝蛋白（275～347殘基）和3個β鏈組成的β片層。活性中心的輔酶PLP與大結構域保守的Lys59可共價結合，PLP 的吡啶環(huán)與 Tyr187（～3.7 ?）形成π堆疊。PLP的其余基團主要通過形成氫鍵與酶結合：PLP的吡啶環(huán)的氮原子與Gln249形成氫鍵；PLP的磷酸基團與Thr233、Ser252和Tyr260的羥基，與Thr233和Gly251的氨基形成氫鍵；PLP的吡啶環(huán)的羥基與Gln81的側鏈氨基及Arg157的胍基形成氫鍵。

D-TAax的催化活性中心含有二價錳離子。錳離子與PLP的醛基相距5距離吡啶環(huán)共軛面 0.4 ?，距 離 His347 的 Nε 原 子 2.2 ?，距 離Asp349的羧基2.2 ?。錳離子與4個水分子配位（1.8～2.3 ?）形成一個扭曲的八面體，作為路易斯酸參與D-TAax的催化過程，對D-TA的立體選擇性具有重要作用[25]。

圖2 D-TA的結構與活性中心

3 TAs的催化機制

3.1 輔酶PLP介導的催化循環(huán)

TAs處于非催化狀態(tài)時，PLP與活性中心特定的賴氨酸殘基形成席夫堿（內部醛亞胺）。含有氨基的底物（Gly、β-羥基-α-氨基酸）進入活性中心，從內部醛亞胺中置換賴氨酸的ε-氨基，與PLP形成新的席夫堿（外部醛亞胺）[14]。外部醛亞胺是TAs催化發(fā)生羥醛縮合和逆向羥醛裂解的共同中間體，Gly是所有TAs通用的α-氨基酸供體[9]。在羥醛縮合過程中，Gly與PLP形成外部醛亞胺PLP-Gly，吡啶環(huán)幫助α-碳的質子轉移至酶催化中心的廣義堿，產(chǎn)生高度共振的陰離子；醛受體進攻α-碳形成C-C鍵，產(chǎn)物通過席夫堿交換機制被釋放出活性中心，PLP則從產(chǎn)物轉移回到活性中心的保守賴氨酸的側鏈重新形成內部醛亞胺，完成一個催化循環(huán)。逆向羥醛裂解過程是由外部醛亞胺βC位的羥基去質子化開始，接著進行C-C鍵的斷裂，最終被裂解為醛和Gly[8,20,22,25]。

3.2 TAs的立體選擇性機制

Uhl等[25]比較了D-TAax和L-TAtm的活性中心，發(fā)現(xiàn)活性中心的位點近似鏡像對稱[25]，可以理解為L-TAtm的活性中心的入口位于PLP吡啶環(huán)的si面（si-face），D-TAax的活性中心入口位于PLP的re面（re-face）（圖3）。因此，當Gly供體與PLP形成外部醛亞胺后，醛受體只能從輔酶PLP吡啶環(huán)的si面進攻α-碳，從而嚴格地控制L-TAs對α-碳的立體選擇性。D-TAs與L-TAs恰好相反的是，醛受體只能從輔酶PLP吡啶環(huán)的re面進攻外部醛亞胺的α-碳，也能非常嚴格地控制DTAs對α-碳的立體選擇性。

圖3 L-TA與D-TA的PLP結合構象呈鏡面對稱

Fesko等[14]進行了一項核磁共振研究，以了解為何L-TAs催化產(chǎn)物β-碳位的快速差向異構化而D-TAs沒有進行快速差向異構化的化學機制。基于PLP介導的TAs催化循環(huán)機理，可以推導出酶促反應過程中產(chǎn)生的中間體（外部醛亞胺PLP-Gly）和底物（Gly、醛受體），將甘氨酸、苯甲醛、酶，以及13C標記的順式產(chǎn)物（syn）與未標記的反式（anti）產(chǎn)物以60∶40的比例混合，測定從順式產(chǎn)物到反式產(chǎn)物和游離Gly的13C標記轉移的相對速率。在動力學控制反應中，L-TA具有中等選擇性，D-TA具有高的選擇性，順式產(chǎn)物為主要部分，而對于L-allo-TA和L-low-TA的產(chǎn)物主要為反式產(chǎn)物。在熱力學控制下，對于所有TAs，得到60/40（syn/anti，d.e.≈20%）的比例。L-TA的限速步驟是甘氨酸與酶活性位點的結合形成Gly-PLP復合物，以及α-碳去質子化的過程，需要較高的活化能。D-TAs的限速步驟是C-C鍵的形成，在動力學控制下D-TA可以獲得高非對映選擇性產(chǎn)物（d.e.＞95%，syn）[14]。

4 TAs的定向進化

天然的L-TAs無法滿足工業(yè)應用的需求。酶的定向進化是提高酶的催化效率、立體選擇性、熱穩(wěn)定性的有效手段。目前，L-TAs定向進化策略主要包括兩類，一類是利用L-TAs基因缺陷型工程菌直接進行篩選[20]，一類是通過檢測L-TAs的催化裂解產(chǎn)物乙醛或芳香乙醛進行篩選[26]。

基因工程改造大腸桿菌使其Gly營養(yǎng)缺陷，含有外源L-TAs基因的陽性克隆可以裂解手性底物產(chǎn)生Gly來維持正常生長，這種方法可用于以Gly為供體的催化反應[27]。利用惡臭假單胞菌KT2440可以苯甲醛作為碳源進行生長的特點，首先使其失去內源性的TAs，通過質粒導入待篩選的TAs基因。陽性克隆以手性苯基絲氨酸作為底物，產(chǎn)生可供其利用的苯甲醛，維持正常增殖[20]，這種方法適用于篩選以芳香醛為醛受體的催化反應。TAs裂解目標底物產(chǎn)生乙醛或芳香醛，利用乙醛脫氫酶（ALDH）在乙醛存在條件下還原NADH，直接測定340 nm波長下的光密度變化間接檢測TAs的催化活性[28]。采用乙酰丙酮分光光度法測定乙醛，也適用于高通量篩選[26]。

Baik等對來源于天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）的L-low-TA進行定向進化，使其催化合成L-threo-DOPS（屈昔多巴）的d.e.值從14%（syn）提升到55%（syn）[29]。第1輪篩選采用自動化的克隆篩選系統(tǒng)（QARRAY lite，X2601，Genetix），挑選了25 000個克隆，在深孔板中培養(yǎng)后，以L-蘇氨酸為底物，利用乙酰丙酮分光光度法檢測裂解產(chǎn)物乙醛進行高通量篩選。4個突變體T2-2（V86I/R241C/Y306C）、T2-4（Y34C）、T3-2（R241C/A287V）和T3-3（Y39C，Y306C）的催化活性和立體選擇性均較好，非對映異構體產(chǎn)物的d.e.分別為21%（syn）、26%（syn）、21%（syn）和38%（syn）。采用易錯PCR技術對T3-3進行隨機突變，在20 000個克隆中獲得2個立體選擇性較高的突變體T3-3m5（Y39C/Y306C/A48T）和 T3-3m7（Y39C，Y306C，R316C），非對映異構體產(chǎn)物的d.e.分別為43%（syn）和28%（syn）。通過2輪篩選發(fā)現(xiàn)突變體 T3-3（Y39C，Y306C）、T3-3m5（Y39C/Y306C/A48T）、T3-3m7（Y39C，Y306C，R316C）均含有Y39C和Y306C突變，推測Y39C和Y306C對提高立體選擇性具有重要貢獻。把T2-4（Y34C）的突變分別引入T3-3、T3-3m5、T3-3m7中，獲得新的突變體T3-3mm1、T3-3mm2、T3-3mm3，產(chǎn)物的d.e.分別為52%、55.4%和49%。突變體T3-3mm2以L-threo-DOPS為底物的特異性常數(shù)比值為1.8×107，與野生型的特異性常數(shù)比值1.1×108相近[17,26,29]。

5 TAs在生物催化合成中的應用

β-羥基氨基酰胺酒石酸是重要的候選藥物，其關鍵中間體（2R，3S）-2-amino-3-hydroxy-3-pyridin-4-yl）-propanoic acid的化學合成須多步反應，且起始物料異腈基乙酸乙酯不穩(wěn)定、有毒，產(chǎn)物為消旋體[30]。采用D-TAax（木糖氧化產(chǎn)堿菌IFO12699）和 D-TAar（節(jié)桿菌DK-38）的催化工藝不僅實現(xiàn)了工藝簡化，還降低了成本。二價金屬離子鈷離子或鎳離子可維持重組D-TAax和DTAar在4℃條件下1周內保持酶活性不變。通過工藝優(yōu)化，從小試放大到100 L體系，獲得的產(chǎn)物均具有很高的d.e.（99.1%，syn）[31]。

L-TAs可以直接催化合成氯霉素的中間體L-4-硝基苯基絲氨酸[16]。余進海等[18]研究了大腸桿菌蘇氨酸醛縮酶催化合成L-4-硝基苯基絲氨酸的工藝，重點考察了溫度、pH、底物濃度、底物比例、反應時間對催化合成的影響。在45℃、pH8.0、甘氨酸濃度500 mmol/L、對硝基苯甲醛濃度100 mmol/L的條件下，反應24 h，轉化率為43%，順式產(chǎn)物與反式產(chǎn)物的比例為2∶1。

L-threo-DOPS為去甲腎上腺素的前體分子，是一種已上市的帕金森癥治療藥物。Gwon等以大腸桿菌JM109為宿主菌表達篩選突變體T3-3mm3（Y34C/Y39C/Y306C/R316C），含有該酶的菌體在-80℃冷凍過夜后直接用于催化合成L-threo-DOPS，在最優(yōu)催化條件（2 mol/L甘氨酸，145 mmol/L 3，4-dihydroxybenzaldehyde，0.6 g/L PLP，50 mmol/L亞硫酸鈉，0.0075 g/L Triton X-100，pH6.5）下，產(chǎn)物的d.e.（60%，syn）相比優(yōu)化前的d.e.（49%，syn）提高了11%[29]。

6 TAs研究展望

D-TA通過工藝優(yōu)化和動力學控制，可以很好地控制β-碳位的立體選擇性，已成功應用于β-羥基氨基酰胺酒石酸的合成。L-TAs還需要進一步的催化機制研究和酶工程改造。通過解析L-TAs與不同立體構型的目標產(chǎn)物或醛受體的復合物晶體結構，有望找到其對β-碳手性控制的關鍵活性位點。在結構的基礎上，可以采用基因突變、計算機模擬（分子動力學、QM/MM等）等研究L-TAs的手性控制機制，尋找潛在的手性控制方法。通過酶工程降低PLP-Gly形成的活化能，亦有望增加L-TAs催化反應的立體選擇性。定向進化可以提高TAs的非對映選擇性。需要注意的是，在篩選和測試酶活性的策略上，以通用底物蘇氨酸為基礎的簡單活性測試方法可能與具體應用存在較大差異。很有必要直接以目標來建立高通量篩選方法。

開發(fā)以L-TAs為生物催化劑的新工藝來生產(chǎn)氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、腎上腺素、屈昔多巴等原料藥的關鍵技術，不僅有望提高此類原料藥的品質，降低合成工藝復雜度，還可以降低生產(chǎn)成本、減少環(huán)境污染。