復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白4表達(dá)情況及其臨床意義研究

張濤，王輝，楊曉文，胡鈞濤，汪超甲，李安榮，周一

腦膠質(zhì)瘤的臨床特征、組織及基因均具有異質(zhì)性，也是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后較差，5年生存者較少超過10%［1-3］。腦膠質(zhì)瘤首選手術(shù)治療，但因其具有侵襲性，無法將病灶完全切除，使術(shù)后復(fù)發(fā)率達(dá)100%［4-5］。復(fù)發(fā)的腦膠質(zhì)瘤會(huì)隨著病情程度加重，其侵襲等生物學(xué)表現(xiàn)也加重，即便經(jīng)綜合治療后病情也不斷進(jìn)展，導(dǎo)致了極高的病死率［6-7］。近年來隨著分子生物學(xué)研究不斷深入，腦膠質(zhì)瘤也開始從分子病理學(xué)展開研究［8］。磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白4（PEBP4）是一個(gè)結(jié)構(gòu)上高度保守的胞質(zhì)可溶性蛋白，可參與調(diào)節(jié)G蛋白耦聯(lián)受體通路、ERK通路、核因子κB（NF-κB）通路等多種重要信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)［9］，在多種惡性腫瘤侵襲、增殖過程中發(fā)揮著重要作用［10］。研究表明，PEBP4對前列腺癌等腫瘤的侵襲、遷移具有促進(jìn)作用，且與部分腫瘤患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)［11］，但其與復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤的關(guān)系研究報(bào)道較為少見。本研究旨在分析復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者PEBP4表達(dá)情況及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年8月—2017年12月十堰市太和醫(yī)院收治的復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者40例，均符合復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1-2］，且經(jīng)歷兩次手術(shù)。另選取本院同期收治的因腦出血或腦創(chuàng)傷而行顱內(nèi)減壓術(shù)的患者40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料完整者；（2）年齡20～80歲；（3）術(shù)前經(jīng)化療、放療等免疫性治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠期與哺乳期婦女；（2）合并其他顱內(nèi)病變者。本研究經(jīng)十堰市太和醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法 所有患者在無菌環(huán)境中提取術(shù)后得到的復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本（復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者）與正常腦組織標(biāo)本（腦出血或腦創(chuàng)傷患者），使用0.9%氯化鈉溶液沖洗壞死組織、血塊與電灼部分組織，并將每個(gè)標(biāo)本分成兩部分，其中一部分置于10%福爾馬林液中浸泡，另一部分則放于5 ml EP凍存管并置于-80 ℃液氮中速凍。

1.2.1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 采用PCR檢測復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本與正常腦組織標(biāo)本PEBP4 mRNA相對表達(dá)量，上游引物序列：5'-TCGGCCAGTGGAACTACACCT-3'，下游引物序列：5'-TCCACCAAGAGCCAAGAGGATAGA-3'。β-actin內(nèi)參引物設(shè)計(jì)，上游引物序列：5'-CCTAGAAGCAnrTG CGGTGCACGATG-3'，下游引物序列：5'-TCATGAAG TGTGACGTrGACATCCGT-3'。

1.2.2 Western blot法 采用Western blot法檢測復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本與正常腦組織標(biāo)本PEBP4蛋白相對表達(dá)量：研磨復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本與正常腦組織標(biāo)本，3 000 r/min離心30 min（離心半徑10 cm）后棄沉淀，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測上清液中蛋白濃度；以聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，封閉1 h，加入山羊抗PEBP4多克隆抗體（1:1 000）、兔抗β-actin多克隆抗體（1:5 000）并置于4 ℃環(huán)境中保存過夜，TBST洗滌后采用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行自顯影。

1.2.3 免疫組化分析 對復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本與正常腦組織標(biāo)本實(shí)施包埋，以4 μm的厚度進(jìn)行切片并封存于山羊血清中，于室溫下等待5 min，滴加（1:200）PEBP4一抗，置于4 ℃環(huán)境下12 h。PBS洗滌后采用室溫孵育30 min，再次使用PBS清洗，采取二氨基聯(lián)苯胺法進(jìn)行染色；采用高倍顯微鏡隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行觀察，同時(shí)每個(gè)視野觀察的腫瘤細(xì)胞為100個(gè)。根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度以及染色陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評分，陽性細(xì)胞率為0～5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，＞50%記3分；細(xì)胞不著色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；將上述得分相加，0～1分為（-），2～5分為（+），6～8分為（++），9分為（+++）。陽性信號標(biāo)準(zhǔn)為棕黃色或黃色，其中（+）、（++）、（+++）為PEBP4陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料分析采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（±s）表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（雙側(cè)）α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PEBP4 mRNA及蛋白相對表達(dá)量 復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本PEBP4 mRNA相對表達(dá)量為（8.24±1.56），高于正常腦組織標(biāo)本的（1.87±0.22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.842，P＜0.01）。復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本PEBP4蛋白相對表達(dá)量為（9.28±1.22），高于正常腦組織標(biāo)本的（1.83±1.32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=28.924，P＜0.01）。正常腦組織標(biāo)本及不同臨床分級復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本PEBP4電泳結(jié)果見圖1。

2.2 PEBP4免疫組化結(jié)果 PEBP4陽性呈黃色、棕黃色顆粒狀，主要見于胞膜或胞質(zhì)。復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本PEBP4陽性表達(dá)率為80.0%，高于正常腦組織標(biāo)本的20.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=28.800，P＜0.05，見圖2）。

2.3 復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本PEBP4陽性表達(dá)的相關(guān)因素 不同性別、年齡、腫瘤直徑復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本PEBP4陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同臨床分級、KPS評分、分化程度復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本PEBP4陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，由于其具有高侵襲性常導(dǎo)致臨床治療較困難，且患者的預(yù)后較差［12-13］。腦膠質(zhì)瘤各個(gè)分級的生物學(xué)行為均具有惡性表現(xiàn)，雖然手術(shù)治療有一定效果，但因腫瘤組織和正常腦組織間界限不明顯而使腫瘤清除不徹底，導(dǎo)致極高的復(fù)發(fā)率［14-16］。目前醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為，腦膠質(zhì)瘤發(fā)生及復(fù)發(fā)過程是多因素、多基因共同參與的生物學(xué)過程［17-18］。復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者平均生存時(shí)間為15個(gè)月左右，傳統(tǒng)化療靶點(diǎn)缺乏特異性，無法分辨正常腦組織和腫瘤組織，易產(chǎn)生治療耐藥性［19-20］。

圖1 正常腦組織標(biāo)本及不同臨床分級復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本PEBP4電泳結(jié)果Figure 1 Electrophoretogram of PEBP4 in normal brain tissue specimens and recurrent glioma specimens with different clinical classification

圖2 復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤及正常腦組織標(biāo)本染色結(jié)果（二氨基聯(lián)苯胺染色，×400）Figure 2 Coloration results of recurrent glioma specimens and normal brain tissue specimens

表1 復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本PEBP4陽性表達(dá)的相關(guān)因素〔n（%）〕Table 1 Related factors of positive expression of PEBP4 in recurrent glioma specimens

PEBP4作為具有磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合能力的堿性家族蛋白，其分子量為21～23 kDa，在多種腫瘤組織中的陽性檢出率均較高。通過對骨髓基質(zhì)細(xì)胞cDNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分離及大規(guī)模篩選發(fā)現(xiàn)，PEBP4主要編碼在901bp中，mRNA序列大多存在于染色體8p21.3上，其可通過激活ERK信號通路而抑制腫瘤壞死因子α的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而在人體代謝中發(fā)揮重要的作用。PEBP結(jié)構(gòu)與PE、核苷酸類、其他疏水配體有著較高親和力，且可分不同亞型，其中PEBP4、RKIP、MRPL38亞型在總體上結(jié)構(gòu)相似，主要區(qū)別于N-末端片段序列［21］。植物類PEBP其同源結(jié)構(gòu)能夠控制枝條生長、花朵結(jié)構(gòu)形態(tài)，哺乳動(dòng)物體內(nèi)PEBP能提高膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的合成，參與調(diào)節(jié)多種疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，高PEBP4能夠激活血管內(nèi)皮生長因子等諸多因子，提高細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，促進(jìn)血管生成，且對惡性腫瘤浸潤有一定作用［22-23］。PEBP4生理功能主要是與PE結(jié)合構(gòu)成細(xì)胞膜，可維持胞膜流動(dòng)性及功能結(jié)構(gòu)的形成［24］。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本PEBP4 mRNA及蛋白相對表達(dá)量高于正常腦組織標(biāo)本，表明復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者PEBP4呈高表達(dá)，分析其可能機(jī)制為高PEBP4可減弱蛋白酶體對磷酸化雌激素受體的降解作用并增強(qiáng)其增殖功能、抑制JNK信號通路、激活A(yù)KT信號通路，繼而通過影響JNK信號通路而發(fā)揮促腫瘤生長作用并維持上皮分化功能，最終導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)［25］。

既往研究表明，直腸癌中PEBP4蛋白相對表達(dá)量升高與腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲等相關(guān)，并與患者放療耐受、生存期呈正相關(guān)［26］；PEBP4高表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤WHO分級有關(guān)，而高表達(dá)PEBP4的腦膠質(zhì)瘤患者病死率較高［27］。本研究結(jié)果顯示，不同臨床分級、KPS評分、分化程度復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本PEBP4陽性表達(dá)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示PEBP4表達(dá)可能與復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者臨床分級、KPS評分、分化程度有關(guān)。

綜上所述，復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者PEBP4呈高表達(dá)，其表達(dá)可能與臨床分級、KPS評分、分化程度有關(guān)，有可能成為判斷復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤的重要標(biāo)志物；但本研究樣本量較小且為單中心研究，相關(guān)因素的納入尚不夠全面，存在一定選擇偏倚，結(jié)果結(jié)論仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。