GeneXpert MTB/RIF對涂陰疑似肺結核及利福平耐藥性檢測的價值

周銀發 李燕平 魏淑貞 林淑芳 趙永 鄭建莉 林建 張山鷹

結核病是一種嚴重威脅人類健康的慢性呼吸道傳染病，2018年WHO[1]估計全球2017年有1000萬例結核病發病患者，中國占9%，位居全球第二；全球估計新發耐多藥和利福平耐藥結核病(multidrug and rifampicin-resistant tuberculosis, MDR/RR-TB)患者55.8萬例，中國占13%，是30個MDR/RR-TB高負擔國家之一。因此，早期發現和治療肺結核患者對于控制結核病傳播具有重要意義。目前，多數結核病防治機構(簡稱“結防機構”)主要依靠痰涂片鏡檢來篩查肺結核，雖然該方法快速、廉價，但由于留痰、涂片及鏡檢過程中受到各種因素的影響，導致分枝桿菌檢出率低，涂片陰性患者較多，易造成誤診漏診，延誤患者診治。痰培養盡管能提高分枝桿菌檢出率，但存在檢測時間長、操作復雜、技術要求高等缺點[2]。而GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)是基于半巢式實時熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)的全自動MTB檢測系統，整個流程在2.5 h內即可完成，并可同時檢測是否對利福平耐藥。本研究通過回顧性對比GeneXpert與傳統痰固體培養(簡稱“痰培養”)及比例法藥物敏感性試驗(簡稱“比例法藥敏試驗”)對涂陰疑似肺結核患者的檢測結果，評價GeneXpert在涂陰疑似肺結核患者診斷及RR-TB 檢測中的價值。

材料和方法

1.資料來源：查閱2018年龍巖市各縣(區)結核病定點醫院及市疾病預防控制中心(簡稱“CDC”)實驗室檢測結果登記本(包括痰涂片鏡檢、MTB痰培養、GeneXpert以及比例法藥敏試驗檢測結果)，并與《結核病管理信息系統》中患者實驗室結果比對后，排除結果不一致及肺外結核患者，共收集659例涂陰疑似肺結核患者的實驗室檢測結果，其中307例行GeneXpert檢測，519例行痰培養及菌種鑒定，228例同時進行Xpert檢測和痰培養檢測。最終622例經臨床診斷為涂陰肺結核，納入同時開展GeneXpert檢測與比例法藥敏試驗檢測的肺結核患者101例，排除3例未檢出結核感染和1例經臨床診斷為非結核與結核分枝桿菌混合感染，最終納入97例進行統計分析。

2.涂陰疑似肺結核診斷標準[3-4]：具有疑似肺結核影像學表現及3次痰涂片鏡檢均陰性的患者。根據診斷性抗感染、抗結核治療或進一步細菌學檢測結果可分為以下3類：(1)確診為涂陰肺結核：進一步細菌學檢查結果為分枝桿菌分離培養陽性，或分子生物學檢查陽性，或肺組織病理學檢查陽性的患者；(2)臨床診斷為涂陰肺結核：無細菌學及肺組織病理學檢查陽性的診斷證據，但具有肺結核疑似癥狀或其他輔助檢查(結核菌素皮膚試驗、γ干擾素釋放試驗及血清結核抗體檢測等)陽性的診斷證據，并且經抗結核藥物治療后有效；(3)其他非肺結核患者：無細菌學或病理學檢查陽性結果，經診斷性抗感染或抗結核藥物治療后排除肺結核診斷。

3. 實驗室檢測方法：(1)痰涂片鏡檢：按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[5]要求，分別收集每例患者的即時痰、夜間痰及晨痰各一份進行涂片和萋-尼染色顯微鏡檢查，并將剩余的痰標本在24 h內用于痰培養和GeneXpert檢測。(2)痰培養：依據《分枝桿菌分離培養標準化程序及質量保證手冊》[6]要求，采用酸性羅氏固體培養基進行MTB分離培養。(3)比例法藥敏試驗：按照《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化程序及質量保證手冊》[7]的要求嚴格操作。(4)GeneXpert檢測：采用Cepheid 公司生產的實時熒光PCR及試劑對患者的痰標本行MTB及RR-TB檢測，操作嚴格按照系統及試劑使用說明書進行。

4.質量控制(簡稱“質控”)：(1)實驗室對每批次染色液均進行質控；每批次酸性羅氏培養基均進行無菌性試驗和藥敏試驗；龍巖市CDC參加國家參比實驗室組織的藥敏試驗熟練度測試歷年來均合格通過；每批次的GeneXpert檢測試劑盒均設立陽性對照(H37Rv)和陰性對照(水)。(2)將從實驗室檢測結果登記本數據與《結核病管理信息系統》中的實驗室檢測結果數據進行比較，排除結果不一致、涂陽以及肺外結核的患者，確保本研究數據的準確性。

5.統計學處理：采用Excel 2016軟件收集并整理數據，運用SPSS 24.0軟件對數據進行統計學分析，不同方法對MTB檢出率(陽性率)的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。一致性檢驗采用Kappa檢驗，Kappa值≤0.40時為一致性差，≥0.75為一致性高度一致，介于二者之間為中度一致。

結 果

1.以臨床診斷為標準評價GeneXpert 檢測的效能：以臨床診斷為標準，GeneXpert檢測MTB的特異度及陽性預測值與固體培養法一致，均為100.00%；但敏感度(31.40%)高于固體培養法(7.46%)，兩種檢測方法與臨床診斷結果一致性均較差。在涂陰疑似肺結核患者中，GeneXpert對MTB的檢出率(29.97%，92/307)明顯高于痰培養 (7.13%，37/519) (χ2=76.30，P<0.05)。詳見表1。

2.以痰培養為標準判斷GeneXpert檢測的效能：以痰培養為標準，GeneXpert檢出MTB的敏感度與陰性預測值均較高，但特異度與陽性預測值較低，兩種檢測方法的結果呈中度一致。200例痰培養陰性患者中有46例(23.00%)GeneXpert檢出MTB。詳見表2。

3. RR-TB檢測結果： 納入同時開展GeneXpert檢測與比例法藥敏試驗檢測的患者101例。在比例法陽性患者中，3例GeneXpert未檢出結核感染(1例經菌種鑒定為非結核分枝桿菌感染)。另外1例為GeneXpert檢出利福平敏感，但比例法檢測結果為利福平耐藥，且菌種鑒定為非結核分枝桿菌，經臨床診斷性治療確診該患者為MTB與非結核分枝桿菌混合感染。余97例(初治87例，復治10例)患者經菌種鑒定及GeneXpert檢測均確診為感染MTB，其中GeneXpert檢測出利福平耐藥患者7例，耐藥率為9.28%(7/97)；比例法藥敏檢測出6例利福平耐藥患者，耐藥率為6.18%(6/97)；兩種方法檢測結果一致率較高(98.97%，96/97)，耐藥率差異無統計學意義(χ2=0.00，P>0.05)。

表1 兩種檢測方法以臨床診斷為標準的診斷效能判斷及比較

注敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%

表2 以固體痰培養為標準Xpert檢測MTB的效能

注敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%

討 論

肺結核是由于MTB感染肺部引發的慢性呼吸道傳染病，細菌學檢查是確診肺結核及RR-TB的重要依據。其傳染源主要是痰涂片陽性(涂陽)患者，但有研究表明大約17%的肺結核是由涂陰患者傳播引起[8]，而臨床上無法從涂陰肺結核患者痰涂片鏡檢獲得細菌學證據，往往需要其他檢測手段來獲得臨床診斷，常因時間較長而影響臨床診治；GeneXpert作為一種操作簡便且檢出時間短的新型分子生物學檢測技術，在早期診斷涂陰肺結核和控制結核病傳播具有重要意義[9]。

國內外學者對GeneXpert系統進行了較多的研究，大多集中在涂陽以及痰培養陽性(培陽)結核病患者，其檢出MTB的敏感度基本可達97.5%以上，甚至達100.0%[2,10-13]；而針對涂陰或痰培養陰性(培陰)結核病患者MTB檢測的研究較少，且報道的結果差別較大，如有文獻顯示，以傳統固體痰培養為金標準，在涂陰疑似肺結核患者中GeneXpert檢測MTB的敏感度為55.2%～90.2%[14-15]。而本研究顯示，GeneXpert對涂陰疑似肺結核患者檢測MTB的敏感度為90.32%，略高于文獻報道的敏感度，但特異度(77.00%)卻低于文獻報道(93.5%～100.0%)[2,11,15]；提示對于涂陰疑似肺結核患者，GeneXpert對MTB的檢出率明顯高于痰培養。這可能與大多數涂陰肺結核患者在進行結核病診斷前均接受過β內酰胺類藥物的治療，而該藥物對MTB有一定的殺滅作用，導致痰標本中MTB荷載量較少或未能及時培養而導致痰培養陰性[16]有關。而GeneXpert是基于定量PCR的分子檢測，能夠從已經滅活的MTB中擴增出MTB核酸并報告診斷，可出現痰培養陰性而GeneXpert檢出陽性的情況[17]。

另外，本研究中GeneXpert檢測RR-TB與比例法藥敏試驗結果呈高度一致性，兩種方法檢出的利福平耐藥率差異無統計學意義，然而GeneXpert檢測時間遠短于比例法藥敏試驗，可以及時為臨床醫生調整治療方案提供細菌學依據；但也有研究表明，分子藥敏試驗檢測對利福平耐藥的穩定性和重復性較比例法藥敏試驗好，但如果GeneXpert檢測應用于初治肺結核患者(非耐藥高危人群)時可能會出現假陽性的可能，因此如果在非耐藥高危人群中檢出結果為對利福平耐藥時，仍需結合臨床和表型藥敏試驗或其他分子藥敏試驗的檢測結果做進一步驗證[18-19]。本次研究還發現，當患者為非結核分枝桿菌與MTB混合感染時，比例法藥敏試驗會受到非結核分枝桿菌優勢菌的影響，僅能檢出對利福平耐藥的非結核分枝桿菌；而對于GeneXpert檢測，即使在非結核分枝桿菌濃度很高、MTB濃度很低的混合感染下，仍能檢出MTB[20]，但本研究僅1例此類患者，可能結論存在偏頗，望今后能進一步研究。

綜上所述，GeneXpert是一種操作簡便、檢出時間短的分子檢測技術，在涂陰疑似肺結核患者中相對于固體痰培養具有較高的MTB檢出率，并且對于RR-TB檢測的敏感度也較高，可推薦作為基層結核病定點醫院臨床快速確診涂陰疑似肺結核及RR-TB的檢測手段，使結核病患者得到及早診斷和治療，對涂陰肺結核以及利福平耐藥肺結核的控制具有重大意義。但目前GeneXpert檢測設備及配套的試劑盒相對于固體痰培養與比例法藥敏試驗的費用均較昂貴，若在基層結核病定點醫療機構推廣使用，則需要政府加大財政投入或醫保政策給予支持。