非結核分枝桿菌菌種鑒定技術研究進展

曾旋 陸堅 徐宇翔 葉濤生

非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是一種機會性致病菌，根據最新的原核生物名稱術語數據庫(http://www.bacterio.net)，已知NTM數量達190余種。其中，約1/3的菌種對人類具有致病性，可導致肺臟、淋巴結、關節、皮膚和軟組織等重要組織器官感染并引起全身播散性疾病[1-2]。NTM的傳播途徑包括經空氣、水、土壤等，同時，也有報道稱奇美拉分枝桿菌(Mycobacteriumchimaera)通過手術室中支持體外心肺循環的加熱器或冷卻器感染心臟介入手術的患者[3]。在贊比亞、中國等國家，NTM在疑似結核病患者中的分離率分別為15.1%、5.4%～10.5%[4-5]；日本的分離率甚至高達27.5%，患病率為24/10萬[6]。由于抗結核和抗NTM的藥物治療方案存在差異，使用抗結核藥物治療NTM病可完全無效，結果延誤疾病診治。因此，準確鑒定分枝桿菌菌屬菌種是實現精準治療的前提，具有重要的臨床意義。筆者將就NTM鑒定技術進展進行綜述。

一、傳統細菌學鑒定法

傳統細菌學鑒定主要基于分枝桿菌的形態和生理生化特征，包括萋-尼抗酸染色法、熒光顯微鏡檢法、傳統固體培養法，以及應用半自動培養系統、培養管式培養系統、全自動培養系統的快速培養法[7]。研究顯示，應用培養系統的快速培養法平均報告時間為13.3～16.9 d，較固體培養基法的21.7 d縮短，差異有統計學意義(P<0.001)[7]。Azadi等[8]總結了65篇對分枝桿菌鑒定的論文，發現痰涂片的敏感度為20%～70%，特異度為95%～98%；培養的敏感度為95%，特異度為98%。目前，分枝桿菌的分離培養仍是診斷分枝桿菌病的“金標準”，且是不同方法學應用評價的參照標準。然而上述方法特異度低，不能將親緣關系密切的分枝桿菌菌種進行準確鑒定。同時，緩慢生長的分枝桿菌形成菌落需8～12周的時間，不利于臨床快速診斷。

二、菌體組成成分鑒定

基于菌體組成成分的NTM菌種鑒定方法主要包括基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法(MALDI-TOF-MS)、免疫層析技術和色譜技術。MALDI-TOF-MS主要是根據菌體蛋白，在磁場的作用下產生不同的軌跡光譜，并與數據庫中的光譜進行比對而得出菌種鑒定結果，具有高效、可靠、廉價的特點。目前，德國布魯克·道爾頓平臺最近更新的分枝桿菌庫V5.0版本共含有853個光譜，可鑒定159種分枝桿菌。法國梅里埃公司的 v4.12 RUO數據庫包含了1286個光譜，可鑒定45種分枝桿菌[9]。MALDI-TOF-MS鑒定菌種的準確性與物種的親緣關系和參考光譜的覆蓋程度相關。Rodriguez-Temporal等[10]對240株NTM臨床分離株進行鑒定，比較了分別應用3.0版和2.0版分枝桿菌庫(德國布魯克·道爾頓平臺)的MALDI-TOF-MS法和PCR反向雜交法鑒定的準確性，結果發現3.0版對192株(80%)分枝桿菌準確鑒定至35個菌種，比2.0版多鑒定出15株NTM，并且差異有統計學意義；PCR反向雜交法對175株(72.9%)菌株準確鑒定至20個菌種。從而得出了MALDI-TOF-MS比PCR反向雜交法更能準確鑒定NTM菌種的結論。另一項研究分別使用MALDI-TOF-MS法、PCR法和DNA-DNA雜交法對75株NTM進行鑒定，結果發現MALDI-TOF-MS法能準確鑒定產黏液分枝桿菌(Mycobacterium mucogenicum)，而上述其他方法則不能[11]。此外，根據菌體成分設計的檢測技術還有基于結核分枝桿菌復合群MPB64分泌蛋白的免疫層析技術和基于菌體脂肪酸、分枝桿菌酸成分的色譜技術。

三、分子生物學技術

隨著分子生物學技術的發展，目前對NTM進行菌種鑒定開展的分子生物學技術項目主要包括PCR-測序、PCR-限制性片段長度多態性(RFLP)、實時熒光定量PCR、分子線性探針雜交技術(molecular line probe assay，LPA)、PCR-反向斑點雜交法、基因芯片技術、全基因組測序等。下文將對不同方法的實驗原理及其菌種鑒定報道進行簡述。

1.PCR-測序：該技術主要依賴生物遺傳結構的多樣性，對特定的靶基因通過PCR進行擴增后，將擴增產物片段進行測序，并與GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)數據庫中的序列進行比對，最終得出菌種鑒定結果。目前常選用的靶基因包括rrs、ITS、hsp65、groES、recA、rpoB、dnaJ、oxyR、pncA、rnpB、sodA、gyrB、secA1。上述基因編碼產物分別為16S rRNA、轉錄間隔區域、熱休克蛋白-65、10-kDa伴侶蛋白、重組蛋白、DNA-定向RNA聚合酶β鏈、伴侶蛋白、過氧化氫誘導基因激活物、吡嗪酰胺酶/煙酰胺酶、核糖核酸酶P催化亞基、過氧化物歧化酶、DNA旋轉酶B亞基、前蛋白轉位酶[12]。韓國的Kim和Shin[13]選取16srRNA、hsp65、rpoB等3個基因片段，設計引物后分別對臨床分離的109株菌株提取DNA，進行PCR、測序和序列比對，結果發現上述3個基因分別將71.30%、86.79%和81.55%的臨床分離株鑒定至菌種水平，3個基因聯合分析時鑒定率為97.50%。由于某些基因片段在不同NTM中同源性高，不能準確鑒定至菌種，因此，同時分析多個基因片段進行菌種鑒定是有必要的。

2. PCR-RFLP：該方法結合了PCR擴增和限制性分析，常選取hsp65、rpoB、16SrRNA、ITS基因進行擴增，并通過限制性內切酶酶切，進行凝膠電泳后得到不同限制性片段譜帶，可結合軟件分析電泳圖譜，進行菌種鑒定和同源性分析，具有簡便、快速、準確、廉價的特點[14-15]。Nour-Neamatollahie等[14]以hsp65基因為靶基因，用限制性內切酶Cfr13Ⅰ(Sau96Ⅰ)和 BstHHⅠ(CfoⅠ)對294 bp的擴增產物片段進行酶切，發現該方法對結核分枝桿菌和鳥分枝桿菌復合群(Mycobacterium avium complex，MAC)進行鑒定的特異度和敏感度均為100%。黃明翔等[16]選取rpoB為靶基因進行擴增后，單一應用限制性內切酶HaeⅢ可鑒定18種NTM，單一應用限制性內切酶MspⅠ可初步鑒定54種NTM，兩者聯合可將77種NTM鑒定至具體菌種。由此可見，聯合應用限制性內切酶進行菌種鑒定也有利于提高準確性。

3.實時熒光定量PCR：基于核酸檢測的實時熒光定量PCR可應用熒光共振能量轉移(FRET)探針、分子信標或TaqMan探針技術來對封閉系統中的擴增產物進行連續檢測，具有低污染風險和同時識別多個目標的優點[17]。此外，還有應用肽核酸(PNA)探針的實時熒光定量PCR檢測。PNA是用不帶電的肽骨架人工合成的DNA類似物，具有良好的雜交性能和穩定的化學、熱、生物性能。Choi等[18]為了評估PNA 探針實時PCR在檢測分枝桿菌復合體(MTBC)和NTM時的應用，以培養法作為金標準，發現該方法對MTBC檢測的敏感度和特異度分別為96.7%(58/60)和99.6%(469/471)，對NTM的敏感度和特異度分別為69.0%(29/42)和100.0%(489/489)。

4.LPA：該方法又稱PCR-單鏈探針反向雜交試驗，目前該檢測方法包括比利時Innoge-netics公司分子線性探針法(INNO-LPA)、德國Hain Lifescience公司GenoType MTBDRplus法、自身免疫性診斷結核分枝桿菌耐藥分子線性探針法和反向雜交結核分枝桿菌耐藥分子線性探針法[19-20]。其中，GenoType MTBDRplus法又稱Hain test，目前臨床應用廣泛。該方法采用商業試劑盒(CM/AS)，CM試劑盒可以識別15種分枝桿菌，包括結核分枝桿菌，而AS試劑盒則鑒別另16種不太常見的NTM。上述試劑盒的原理為針對23S rRNA基因區域的DNA擴增，然后與固定在膜條帶上的特異性寡核苷酸探針進行反向雜交，以鑒定菌種[21]。Singh等[21]采用Hain test并使用CM/AS試劑盒對60株NTM進行鑒定，發現58株(96.7%)NTM被正確鑒定。

5.PCR-反向斑點雜交法：該方法是利用生物素等標記的探針和特異性擴增PCR產物(靶DNA序列)雜交快速檢測某基因的測試，并通過顯色鑒定菌種。Wu等[22]對27株分枝桿菌標準株和340株臨床分離的分枝桿菌作為研究菌株，比較了PCR-反向斑點雜交法、傳統鑒定方法和測序鑒定菌種的準確性，發現PCR-反向斑點雜交法與測序鑒定菌種相比較，其準確率達99.1%。

6.基因芯片技術：該技術是在一塊基片表面固定序列已知的靶核苷酸的探針，利用核酸探針雜交的原理，與提取的菌種核酸擴增產物且被擴增為帶有熒光分子的 DNA片段進行雜交，通過熒光顯色而進行菌種鑒定，具有快速、靈敏、特異的特點。唐曙明等[23]選取ITS建立的基因芯片技術對23種分枝桿菌標準菌株和9種非分枝桿菌菌株鑒定，特異度為100%。Srilohasin等[24]則基于51個單核苷酸多態性基因位點(SNPs)開發的基因芯片，擁有99.85%的基因分型檢出率，100.00%轉化率，99.75%的再現率，99.85%的準確率，能夠在6 h內檢出MTBC，顯示出該技術的簡單、靈活、快速。此外，還有基于gyrB、16SrRNA等基因的核苷酸序列開發的基因芯片技術[25]。

7.全基因組測序：自從1977年第一代DNA測序技術(Sanger法)發展至今，已出現第四代測序技術[26]。目前用于菌種鑒定的全基因組測序技術為二代測序技術，作為菌種鑒定的“金標準”，該技術存在花費高、耗時長的缺點，主要用于科學研究，不利于臨床應用[27]。

四、展望

目前，傳統鑒定技術存在敏感度低、耗時長的缺點，然而，由于其花費低，仍被廣泛應用于臨床。與傳統鑒定方法相比，MALDI-TOF-MS和分子生物學技術已大大提高NTM鑒定的準確率，其中MALDI-TOF-MS、實時熒光定量PCR、LPA、基因芯片等方法已在大型醫院或結核病專科醫院應用，但仍存在儀器設備價格昂貴或技術要求高等缺點，不利于充分推廣。未來，建立一種快速可靠、成本低廉、操作簡便的標準化體系是鑒定NTM的趨勢。