不同方法檢測利福平耐藥結核病及MTBrpoB基因突變的對比分析

林勇明 黃曉偉 林淑芳 魏淑貞 林建 趙永

耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)是當前結核病控制工作的重點與難點，有效防控MDR-TB是整個結核病控制工作進程的關鍵控制點。研究表明，大多數對利福平耐藥的MTB菌株同時也對異煙肼耐藥[1]，MTB對利福平的耐藥情況一定程度上可以反映該地區的MDR-TB疫情。基因突變是產生耐藥MTB的根本原因，RNA聚合酶β亞基(rpoB基因)突變可引起96%以上的MTB臨床分離株對利福平耐藥[2]，MTB對利福平耐藥的決定區(rifampin resistance-determining region，RRDR)主要位于507～533區[3]。目前，MTB耐藥性檢測的“金標準”仍然是表型藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，核酸反向線性探針雜交技術(屬于GenoType MTBDRplus方法，簡稱“MTBDRplus”)和利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(GeneXpert MTB/RIF，簡稱“Xpert技術”)。但在臨床實際中，3種方法檢測結果對部分菌株是否存在利福平耐藥性會出現不同，為了解此類菌株的基因突變情況，筆者對其進行了3種方法的耐藥性檢測，并進行了ropB基因測序，并將測序結果與檢測結果進行對比分析與評價。

資料和方法

一、研究對象

搜集2017年福建省泉州市所轄10個縣(市、區)結核病定點醫院登記的511例確診肺結核患者，同時經比例法、MTBDRplus與Xpert技術等3種方法檢測對利福平的耐藥情況，并對3種方法檢測結果不相同但至少1種結果為對利福平耐藥的66株 MTB行ropB基因測序，并對55株獲得基因測序結果的菌株進行ropB基因突變情況分析。H37Rv標準株由國家結核病參比實驗室提供。

二、研究方法

1.主要儀器和試劑：主要儀器有隔水式恒溫培養箱，GeneXpert MTB/RIF檢測系統(購自美國Cepheid公司)，水浴鍋(購自中國上海精宏公司)，PCR擴增儀(購自美國ABI公司),微生物核酸雜交儀(TwinCubator，購自Hain 生命科學股份有限公司，德國)；主要試劑有羅氏藥敏試驗培養基(購自中國珠海貝索生物技術有限公司)、GeneXpert MTB/RIF試劑盒和GenoType MTBDRplusV2試劑盒(均購自美國賽沛公司)。

2.患者入選標準：(1)根據《WS 288—2017 肺結核診斷》[4]，痰標本分枝桿菌分離培養陽性并經初步菌種鑒別為結核分枝桿菌復合群的患者確診為肺結核。(2)對利福平耐藥：根據《結核病實驗室檢驗規程》[5]，固體比例法中，耐利福平菌落大于1%則判斷為利福平耐藥；Xpert檢測結果在檢測系統可直接報告是否對利福平耐藥；MTBDRplus檢測根據試劑盒說明書進行操作，如果rpoB基因區至少有1個野生型探針WT缺失或突變型探針Mut染色陽性，則表示試驗菌株對利福平耐藥[6]。

3. 痰涂片、痰培養及Xpert檢測：本研究按照《結核病實驗室檢驗規程》[5]的要求對收集的痰標本進行萋-尼染色顯微鏡檢查；痰涂片陽性患者由縣級結核病定點醫院實驗室負責進行痰培養，有條件的實驗室同時按照《結核病實驗室檢驗規程》[5]對痰涂片陽性標本進行Xpert檢測。

4.藥敏試驗：由市疾病預防控制中心定期收集轄區內各縣級結核病定點醫院實驗室痰涂片陽性的痰標本及痰培養管，對所有1279株培陽標本采用對硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)[6]進行初步菌種鑒別，鑒別結果包括MTB 1169株，非結核分枝桿菌(NTM)110株。對鑒定為MTB的臨床分離株應用固體比例法進行一線抗結核藥物的藥敏試驗，同時采用隨機數字表法抽取711株MTB臨床分離株按照《結核病實驗室檢驗規程》進行MTBDRplus 檢測，最終有511株同時進行了Xpert檢測、傳統藥敏試驗和MTBDRplus檢測。

5.細菌DNA制備：取常規L-J培養基培養2～3周、生長良好的MTB一菌環菌落溶于400 μl三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)緩沖液(pH 8.0)中，在旋渦振蕩器上振蕩至菌落呈塊狀固體，并將其均勻溶于TE緩沖液中，在95 ℃水浴15 min后，離心半徑4 cm，3000 r/min，離心5 min，取上清。

6.聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)：從http://www.ncbi.nlm.nih.gov的GenBank 獲得H37Rv的rpoB基因序列。采用Primer Premier 5.0軟件設計引物：上游引物F為5′-GAG CCC CCG ACC AAA GA-3′，下游引物R為5′-ATG TTG GGC CCC TCA GG-3′，片段長629 bp[含密碼子507～533的利福平耐藥決定區(rifampin resistance determining region，RRDR)]。反應體系共50 μl，包括2×Taq PCR Master Mix 25 μl、上下游引物各1 μl(10 μmol/L)，模板10 μl，去離子水13 μl。PCR擴增條件：94 ℃變性8 min；94 ℃ 30 s，30個循環；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；再72 ℃延伸5 min。

7. DNA測序和分析：PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證為擴增的單一目的條帶后，產物送上海生物工程公司利用基因測序技術，分別對試驗菌株的rpoB基因進行序列分析。通過BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 將試驗菌株的rpoB基因測序結果與H37Rv的相應基因序列進行比對分析，獲得各菌株耐藥基因突變位點及突變特征。

三、統計學處理

采用Excel 2007錄入結果數據，SPSS 11.0軟件進行數據的統計學分析，計數資料的比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法(當理論頻數<5時)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、MTBDRplus與Xpert檢測利福平耐藥情況

511株檢測菌株中，比例法、MTBDRplus、Xpert技術檢測到利福平的耐藥率分別為38.16%(195/511)、40.51%(207/511)、45.99%(235/511)，MTBDRplus技術與比例法檢測的利福平耐藥率差異無統計學意義(χ2=0.590，P=0.442)；而Xpert技術檢測的利福平耐藥率明顯高于比例法(χ2=6.424，P=0.011)。

以比例法檢測結果為標準，Xpert檢測利福平耐藥的敏感度(93.85%)與MTBDRplus(95.39%)間的差異無統計學意義(χ2=0.453，P=0.501)；而MTBDRplus的特異度(93.35%)和一致率(94.13%)均明顯高于Xpert技術[分別為83.54%和87.48%](χ2=14.88、13.54，P值均=0.000)。詳見表1。

二、ropB基因突變情況

檢測的511株菌株中，3種方法檢測結果不完全相同的菌株有66株，其中55株獲得rpoB基因序列，7株凍存的菌株未能成功傳代致DNA提取失敗，4株未能獲得測序結果。

1. 測序菌株的ropB基因突變情況：獲得rpoB基因序列的55株菌株中，47株(85.46%)ropB基因在371～566位點間的17個位置發生了36種類型的突變，其中372、373、374、376、377、378、379、382、516和526等10個氨基酸位點均分別發生了2種或2種以上類型的突變，尤以377位明顯[42株(76.36%)發生了6種類型的突變]，其次為511位[7株(12.73%)發生了1種類型的突變]。其中13株(23.64%)發生堿基缺失或插入(均在377位)；7株(12.73%)發生點突變，有5株(71.43%)發生在RRDR區外；27株(49.09%)發生聯合突變，有11株(40.74%)發生在RRDR區外。另外，40株(72.73%)菌株內還發現50個無意義突變(即不影響編碼蛋白的表達，結構或功能無明顯變化)。詳見表2。

表1 以比例法為標準，不同方法檢測MTB臨床分離株利福平耐藥性的檢測效能

注敏感度=真耐藥株數/(真耐藥株數+假敏感株數)×100%，陽性預測值=真耐藥株數/(真耐藥株數+假耐藥株數)×100%，特異度=真敏感株數/(假耐藥株數+真敏感株數)×100%，陰性預測值=真敏感株數/(假敏感株數+真敏感株數)×100%，一致性=(真耐藥株數+真敏感株數)/總株數×100%

表2 55株獲得基因序列的MTB菌株rpoB基因突變分布情況

續表2

注“-”代表 “缺失

表3 3種方法檢測利福平耐藥結果異同的MTB臨床分離株rpoB基因突變情況

注突變率=(點突變菌株數+聯合突變菌株數+缺失或插入菌株數)/獲得基因序列菌株數×100%

2. 利福平耐藥結果異同菌株的ropB基因突變情況：55株獲得rpoB基因序列中，45株為比例法檢測利福平敏感而分子藥敏試驗(1種或2種方法)檢測為耐藥，其中40株(88.89%，40/45)rpoB基因發生有意義突變，包括15株(37.50%，15/40)發生在RRDR區(2株為RRDR區點突變，13株為聯合RRDR區位點突變)；8株為比例法檢測利福平耐藥而MTBDRplus與Xpert檢測均敏感，其中6株rpoB基因發生有意義突變(即影響編碼蛋白的表達，結構或功能有明顯變化；包括2株為聯合RRDR區位點的突變)。比例法與分子藥敏試驗檢測利福平耐藥結果不一致的兩類菌株之間突變率差異無統計學意義(Fisher確切概率法，P=0.121)。詳見表3。

3. MTBDRplus與Xpert檢測結果異同菌株的ropB基因突變情況：測序的55株菌株中，MTBDRplus與Xpert檢測利福平耐藥結果相同的菌株有22株，兩者均耐藥的14株菌株均發生ropB基因突變，其中10株(71.43%，10/14)在RRDR區位點發生突變；而兩者均敏感的8株菌株中，有6株菌株ropB基因發生突變，其中只有1株在RRDR區位點發生突變。MTBDRplus與Xpert檢測利福平耐藥結果不同的菌株有33株，其中31株為MTBDRplus檢測敏感而Xpert檢測為耐藥，有26株(83.87%)在ropB基因的371～566位點間的13個位置發生了25種類型的突變，但只有1株(3.85%，1/26)在RRDR區位點發生突變；2株為MTBDRplus檢測耐藥而Xpert檢測為敏感，其中1株在ropB基因的373、377和516的位置發生了3種類型的聯合突變。

討 論

控制耐多藥結核病，除了有效的治療管理外，通過快速診斷耐藥結核病患者，做到早期發現、早期合理治療，對預防MDR-TB的發生和傳播至關重要。目前我國耐藥結核病的診斷仍然主要依靠傳統的涂片、培養和藥敏試驗。抗酸桿菌痰涂片鏡檢方法操作簡便、快速、經濟、特異度強，因此在基層實驗室應用最為廣泛，但敏感度較低；固體培養以改良羅氏培養基為主，敏感度較涂片鏡檢高，價格較低廉，但陽性培養結果一般需要1個月左右才能報告，陰性結果則需要等待2個月方可報告；采用固體比例法藥敏試驗和液體藥敏試驗分別需要1個月和2 周左右才能報告藥敏試驗結果，故傳統的藥敏試驗遠遠不能滿足臨床診治的需要；而目前只有分子檢測能夠快速發現耐藥MTB，因此建立快速且可靠的藥敏試驗方法是目前結核病基礎研究領域的重點。

基于以上原因，WHO[7]于2015年推薦使用線性探針檢測(line probe assay，LPA)和Xpert兩種技術。本研究顯示，MTBDRplus和Xpert技術用于MTB臨床分離株檢測對利福平耐藥的敏感度分別達到95.39%和93.85%，和國內其他學者報道相似[6,8]，提示分子藥敏試驗檢測利福平耐藥性具有較高的敏感度，其及時發現和快速診斷MDR-TB方面的作用已得到廣大結核病防治人員的接受與認可[7-8]。然而由于不同檢測方法間敏感度與特異度的差異，會出現不同方法檢測同一菌株時對利福平是否耐藥的結果不相同，使臨床診斷造成困惑。

表型藥敏試驗檢測利福平為敏感而分子藥敏試驗檢測為耐藥(至少1種或2種方法檢測均耐藥)的菌株，經基因測序復核，88.89%的菌株在ropB基因發生有意義的突變，突變位點廣泛，以聯合突變為主，近2/3的突變發生在RRDR區外，而表型藥敏試驗檢測對利福平耐藥、分子藥敏試驗檢測對利福平敏感的8株菌株中有75.00%的菌株有rpoB基因發生有意義突變，但也有2株菌株未發生突變，與國內其他研究差別較大[10-14]。對于二者檢測產生不同結果的可能原因如下：(1)可能臨床患者中存在異質性耐藥菌株[15]；(2)推測ropB基因RRDR區外還存在影響MTB對利福平耐藥的其他未知機制[16]；(3)非ropB基因突變引起耐藥，等等。

研究結果還顯示，MTBDRplus技術的特異度和一致率均高于Xpert 技術，若未進行基因復核，僅以表型藥敏試驗為“金標準”，Xpert技術檢測結果可能會出現更多的“假陽性”結果。通過對66株菌株ropB基因測序發現，MTBDRplus與Xpert技術檢測利福平均耐藥的14株菌株ropB基因的突變位點10株(71.43%)發生在RRDR區內；而兩者結果均敏感的8株菌株和不一致的33株菌株，分別有5株和25株發生的ropB基因突變位點都在RRDR區外，提示臨床實踐中，經分子藥敏試驗檢測耐藥而表型藥敏試驗檢測為敏感的菌株，不能輕易判斷分子檢測結果為“假陽性”。

本研究僅對3種方法檢測結果不相同且至少1種結果為利福平耐藥的66株菌株進行了ropB基因測序，僅55株獲得了基因測序結果，不能以基因測序為標準判斷不同方法檢測MTB臨床分離株對利福平耐藥的效能，僅揭示部分菌株存在的基因突變，無法進一步深入分析其耐藥與突變的機制。

綜上所述，MTB對利福平是否耐藥的結果判斷時應遵循《結核分枝桿菌耐藥性檢測專家共識》[15]原則，只要任何一種方法檢測為利福平耐藥，首先應考慮該株MTB對利福平耐藥；應盡快采用其他檢測方法進行驗證，同時結合異煙肼耐藥性的篩查，以便及早發現、診斷MDR-TB患者。