頂空毛細(xì)管GC法測定匹多莫德原料藥中6種溶劑的殘留量

王玉霞，郝桂明，王 衛(wèi)

(天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070)

匹多莫德(pidotimod)化學(xué)名為(R)-3-[(S)-(5-氧-2-吡咯烷基)羰基]-噻唑烷-4-甲基，是由意大利Poli化學(xué)公司研發(fā)，1993年上市的一種新型免疫調(diào)節(jié)劑[1]。匹多莫德作為廣譜免疫調(diào)節(jié)劑，可通過多個(gè)環(huán)節(jié)增強(qiáng)肌體抗感染免疫反應(yīng)，提高免疫低下患者的肌體免疫應(yīng)答水平[2]。統(tǒng)計(jì)國內(nèi)現(xiàn)有企業(yè)匹多莫德原料的合成工藝，在后三步中共使用了甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、異丙醇和甲苯6種溶劑，但對這6種溶劑的檢測方法在國內(nèi)尚未見完整報(bào)道[3]。筆者建立了以頂空毛細(xì)管氣相色譜法同時(shí)測定上述6種溶劑殘留量的方法，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確，可操作性強(qiáng)，可用于匹多莫德原料藥中6種殘留溶劑的檢測。

1 儀器與試藥

Agilent 7890A氣相色譜儀，Agilent 7697A頂空進(jìn)樣器。甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺均為色譜純(默克股份兩合公司)，乙酸乙酯、二氯甲烷、異丙醇、甲苯均為色譜純(天津市康科德科技有限公司)，水為純化水。匹多莫德由4個(gè)生產(chǎn)廠家提供，廠家1#(批號TD20150101、TD20150102、TD20150901)、廠家2#(批號Y2150102、Y2150107、Y2151221)、廠家3#(批號Z140907、Z170908、Z150102)、廠家4#(批號04.1015-151210、04.1015-151212、04.1015-151213)，共12批樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為DB-624毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm，1.8 μm)；進(jìn)樣口溫度為200 ℃，檢測器溫度為250 ℃；起始溫度為60 ℃，維持5 min，以20 ℃/min的速率升溫至170 ℃，維持4 min；頂空瓶平衡溫度為80 ℃，平衡時(shí)間為15 min。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液 取本品適量，精密稱定，加N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋制成每1 ml中含100 mg的溶液。

2.2.2對照品溶液 精密稱取甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、異丙醇和甲苯適量，加N,N-二甲基甲酰胺定量稀釋制成每1 ml中含甲醇300 μg、乙醇500 μg、乙酸乙酯500 μg、二氯甲烷60 μg、異丙醇500 μg和甲苯89 μg的溶液，作為對照品溶液。精密量取對照品溶液和供試品溶液各5 ml分別置頂空瓶中，密封。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，見圖1。

1.甲醇 2.乙醇 3.異丙醇 4.二氯甲烷 5.乙酸乙酯 6.甲苯圖1 對照品(A)供試品TD20150101(B)供試品Y2150102(C)供試品Z140907(D)供試品04.1015-151210(E)氣相色譜圖

2.3線性范圍 分別精密稱取6種殘留溶劑適量，用N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋使成每1 ml中含甲醇0.6 mg、乙醇1.0 mg、乙酸乙酯1.0 mg、二氯甲烷0.12 mg、異丙醇1.0 mg和甲苯0.178 mg的對照貯備液，用N,N-二甲基甲酰胺逐步稀釋使成梯度濃度。分別精密量取上述溶液各5 ml，置頂空瓶中，密封，進(jìn)樣。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，分別進(jìn)行線性回歸，結(jié)果6種溶劑的濃度與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。見表1。

表1 線性范圍考查結(jié)果

2.4精密度試驗(yàn) 取對照溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲苯峰面積的RSD分別為6.4%、6.5%、6.0%、4.3%、3.8%和3.7%，均符合《中國藥典》規(guī)定。

2.5重復(fù)性試驗(yàn) 取匹多莫德樣品(廠家4#，批號04.1015-151210)制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，檢出甲醇含量的均值為0.01%，RSD為7.8%，其余均未檢出。

2.6加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品0.5 g，共9份，置頂空瓶中，分別精密加入相當(dāng)于80%、100%和120%限度的對照品溶液各5 ml，使樣品完全溶解，密封，進(jìn)樣。結(jié)果甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲苯的平均回收率分別為97.6%、97.9%、100.8%、95.1%、100.4%和95.6%,RSD分別為0.8%、1.7%、0.7%、2.9%、2.3%和2.7%。見表2-7。

表2 甲醇回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表3 乙醇回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表4 異丙醇回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表5 二氯甲烷回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表6 乙酸乙酯回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表7 甲苯回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.7最低檢出限 取對照品溶液，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至梯度濃度，使信噪比約為3，最低檢出濃度分別為甲醇6 μg/g(0.000 6%)、乙醇10 μg/g(0.001%)、異丙醇10 μg/g(0.001%)、二氯甲苯12 μg/g(0.001 2%)、乙酸乙酯5 μg/g(0.000 5%)、甲苯1.78 μg/g(0.000 2%)。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對照品溶液和供試品溶液(廠家4#，批號04.1015-151210)于0、24和48 h分別進(jìn)樣，對照品溶液中甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲苯的RSD分別為0.9%、3.1%、3.3%、2.3%、3.4%和7.5%，表明對照品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。供試品溶液中檢出甲醇，RSD為3.0%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9樣品測定 取各廠家各批次樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，測定各批次樣品的溶劑殘留量。結(jié)果見表8。

表8 各批樣品的殘留溶劑測定結(jié)果

3 討論

3.1溶劑的選擇 在最初的研究過程中，從經(jīng)濟(jì)與環(huán)保的角度考慮選用純化水作為溶劑，但是在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，甲苯的線性較差，線性相關(guān)系數(shù)為0.995 9。在之后的研究中選擇 N,N-二甲基甲酰胺為溶劑，6種殘留溶劑的線性均較好，連續(xù)進(jìn)樣重復(fù)性較好。考慮甲苯不溶于水，在水中的分布不均勻，所以線性較差。故在最終的試驗(yàn)中選擇N,N-二甲基甲酰胺作為溶劑。

3.2頂空平衡溫度和平衡時(shí)間的選擇 取“2.2.2”項(xiàng)下的對照品溶液共3份，分別在75、80和85 ℃下加熱平衡20 min，試驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇和乙醇的峰面積隨著平衡溫度的升高而增大，當(dāng)平衡溫度為80 ℃時(shí)，6種溶劑的峰面積趨于穩(wěn)定，綜合考慮選擇平衡溫度為80 ℃。另取“2.2.2”項(xiàng)下的對照品溶液共3份，分別在80 ℃下加熱10、15和20 min，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)平衡時(shí)間達(dá)到15 min后，各個(gè)溶劑的峰面積不再隨著平衡時(shí)間的延長而改變，故選擇平衡時(shí)間為15 min。

《中國藥典》2015年版(四部)規(guī)定的甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、異丙醇和甲苯的殘留限度分別為不得超過0.3%、0.5%、0.5%、0.06%、0.5%和0.089%[4]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，4個(gè)生產(chǎn)廠家的12批樣品檢測均符合規(guī)定。

綜上所述，本方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確、可操作性強(qiáng)，可以用于匹多莫德原料藥中6種殘留溶劑的檢測。