醋酸環丙孕酮有關物質和含量測定方法研究

安 彥，王 衛

(天津市藥品檢驗研究院，天津 300070)

醋酸環丙孕酮為一種抗雄激素藥物，可抑制雄激素的作用，并表現出孕激素和抗促性腺激素的作用。臨床中醋酸環丙孕酮常與炔雌醇制成復方制劑，或與鹽酸吡格列酮、醋酸亮丙瑞林等藥物聯合使用，適應癥包括：自身免疫性孕酮皮炎、功能性子宮出血、多囊卵巢綜合癥及子宮內膜異位等病癥的治療[1-4]。經查詢，目前該品種尚未收入《中國藥典》，國內質量標準收載于《國家藥品標準新藥轉正標準》第90冊，標準號為WS1-(X-040)-2010Z(以下簡稱國標)。現行國外藥典中，《美國藥典》第44版(USP 44版)未收載該品種，《英國藥典》2018版(BP 2018)及《歐洲藥典》9.4版(EP 9.4)均有收載。本次研究在比對國內外現行質量標準和方法基礎上[5-7]，優化試驗條件，使有關物質和含量測定方法更具合理性和有效性，增強方法的可控性。經國家藥品監督管理局網站查詢，我國醋酸環丙孕酮的生產企業有湖北葛店人福藥業有限公司、浙江仙琚制藥股份有限公司及上海創諾制藥有限公司，共三家企業，本次試驗樣品來自前兩家企業。

1 儀器與試藥

Agilent 1100色譜工作站；Waters e2695色譜工作站；METTLER XSE205DU天平；色譜柱：Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；Phenomenex C18柱(150 mm×4.6 mm,3 μm)；Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；Waters C18柱(125 mm×4.6 mm,3 μm)；乙腈為Merck色譜純；水為純化水；醋酸環丙孕酮對照品(批號10053-201602；純度99.7%)、醋酸甲羥孕酮對照品(批號100001-201305，純度99.6%)均來自中國食品藥品檢定研究院，醋酸環丙孕酮雜質對照品(EP對照品，含雜質F和雜質I，批號Y0001223)、醋酸環丙孕酮雜質定位對照品(EP對照品，批號Y0001390)、醋酸地馬孕酮對照品(進口對照品，Trc-canada公司，批號1-CHG-104-2)；醋酸環丙孕酮樣品分別由浙江仙琚制藥股份有限公司(樣品編號1、2)和湖北葛店人福藥業有限公司(樣品3、4、5)提供。

2 方法與結果

2.1色譜條件 采用Phenomenex C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,3 μm)，以乙腈-水(45∶55)為流動相，檢測波長為254 nm，柱溫為40 ℃，進樣體積為20 μl。

2.2溶液制備

2.2.1有關物質溶液 取本品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 ml中含2 mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.2.2含量測定溶液 精密稱定本品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 ml中約含0.2 mg的溶液，作為含量測定供試品溶液；另取醋酸環丙孕酮對照品適量，精密稱定，同法制備，作為對照品溶液。

2.3系統適用性試驗 稱取醋酸地馬孕酮對照品約5 mg，置25 ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，量取5 ml，加流動相稀釋至50 ml，搖勻，量取1 ml，加入已稱取醋酸環丙孕酮約20 mg的10 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統適用性溶液。色譜圖中醋酸環丙孕酮與醋酸地馬孕酮的分離度為2.5，見圖1。

1.醋酸地馬孕酮(雜質Ⅴ) 2.醋酸環丙孕酮圖1 系統適用性試驗色譜圖

2.4線性試驗

2.4.1有關物質線性試驗 精密稱取醋酸環丙孕酮對照品適量，加乙腈溶解并稀釋成每1 ml中含5 mg的溶液，作為對照品貯備溶液；精密量取對照品貯備溶液適量，分別加流動相稀釋制成濃度為0.4、2.0、5.0、10.0、20.0、25.0和30.0 μg/ml的系列溶液，分別精密量取上述溶液20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；以醋酸環丙孕酮的濃度為橫坐標(C)，以相對應的峰面積為縱坐標(A)，進行線性回歸。結果表明：醋酸環丙孕酮自身對照溶液在0.4～30.0 μg/ml的濃度范圍內與其峰面積呈良好線性關系，其線性方程為A=22.16C+0.227(r=0.999 99，n=7)。

2.4.2含量測定線性試驗 精密稱取醋酸環丙孕酮對照品約20 mg，加流動相溶解并稀釋至50 ml，作為對照品貯備溶液；精密量取對照品貯備溶液適量，分別加流動相稀釋制成濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.40 mg/ml的系列溶液，分別精密量取上述溶液20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；以醋酸環丙孕酮的濃度為橫坐標(C)，以相對應的峰面積為縱坐標(A)，進行線性回歸。結果表明：醋酸環丙孕酮供試液在0.05～0.40 mg/ml的濃度范圍內與其峰面積呈良好線性關系，其線性方程為A=22.43C-45.16(r=0.999 99，n=7)。

2.5最低檢出限(靈敏度試驗) 精密量取對照溶液適量，采取逐步稀釋法測定，在與有關物質供試品溶液及對照溶液相同的標尺下記錄色譜圖，經試驗，溶液濃度稀釋至自身對照溶液濃度的0.02倍時，主峰可清晰分辨，主峰信噪比為12。

2.6精密度試驗

2.6.1有關物質精密度 取供試液和對照溶液，按“2.1”項下方法測定，計算連續6針對照溶液主峰、供試液主峰、單雜及總雜的RSD，結果依次為0.77%、0.27%、0.96%和1.16%，表明精密度良好。

2.6.2含量測定精密度 按“2.2.2”項下方法制備供試液和對照品溶液，按“2.1”項下方法測定，計算連續6針供試液和對照品溶液主峰的RSD，結果分別為0.3%和0.1%，表明精密度良好。

2.7重復性試驗

2.7.1有關物質重復性試驗 取同一批號醋酸環丙孕酮樣品分別稱取6份，按“2.2.1”項下方法制備供試液，按“2.1”項下方法測定，計算6份供試液中雜質Ⅰ、單雜及總雜結果的RSD依次為7.3%、0.9%和1.9%，表明重復性良好。

2.7.2含量測定重復性試驗 取同一批號醋酸環丙孕酮樣品分別稱取6份，按“2.2.2”項下方法制備供試液，按“2.1”項下方法測定，計算6份供試液含量的RSD，結果為0.3%，表明重復性良好。

2.8溶液的穩定性試驗 取有關物質對照溶液及供試品溶液在室溫下分別放置44和32 h，期間分別測定5個不同時間點的溶液穩定性，計算對照溶液主峰面積、供試液主峰面積、單雜峰面積及總雜峰面積的RSD，試驗結果表明，對照溶液在44 h內、供試品溶液在32 h內穩定。另取含量測定對照品溶液及供試品溶液在室溫下放置27 h，期間分別測定5個不同時間點的溶液穩定性，計算對照品溶液主峰面積和供試液主峰面積的RSD，試驗結果表明對照品溶液和供試品溶液在27 h內穩定。

2.9準確度試驗 取5批醋酸環丙孕酮樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試液，按“2.1”項下方法測定，計算含量。再取上述樣品按照現行質量標準(國標)進行測定，經比較，兩種方法的測定結果一致，方法準確，結果見表1。

表1 方法準確度結果

2.10破壞試驗

2.10.1酸破壞 精密稱取本品約0.2 g，加乙腈15 ml使溶解，加入1 mol/L鹽酸溶液15 ml回流1 h，放冷，滴加1 mol/L氫氧化鈉溶液至中性，轉移并加流動相至100 ml。經與醋酸環丙孕酮混合雜質對照品及醋酸環丙孕酮雜質定位對照品比對，主要降解產物的保留時間與雜質Ⅲ和雜質Ⅵ一致，見圖2。

2.10.2堿破壞 精密稱取本品約0.2 g，加乙腈15 ml使溶解，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液15 ml常溫放置過夜，經比對，主要降解產物的保留時間及光譜圖與雜質Ⅲ一致，見圖2。

2.10.3氧化破壞 精密稱取本品約0.2 g，置100 ml量瓶中，加乙腈15 ml使溶解，加入過氧化氫濃溶液15 ml，放置過夜，加流動相至刻度，結果表明主峰可降解出未知雜質，見圖2。

2.10.4光照破壞 精密稱取本品約0.1 g，加流動相溶解并稀釋至50 ml，經4 500 lx光照72 h后測定，未發生明顯變化，見圖2。

2.11已知雜質的命名和定位 按照EP 9.4(BP 2018)，有關物質混合雜質對照品中含有雜質F和雜質I，雜質定位對照品中含有雜質B、雜質C、雜質E和雜質G，本次研究工作制備了醋酸環丙孕酮及6個已知雜質對照品的混合溶液，采集圖譜(見圖3)并重新計算了已知雜質的相對保留時間，根據《中國藥典》的命名習慣，按雜質出峰順序依次命名為雜質Ⅰ～雜質Ⅵ，詳見表2。

表2 已知雜質對照表

1.未知雜質 2.雜質Ⅲ 3. 醋酸環丙孕酮 4.雜質Ⅵ圖2 酸破壞(A)堿破壞(B)氧化破壞(C)光照破壞(D)未破壞樣品(E)HPLC色譜圖

2.12樣品測定和耐用性試驗 取5批樣品分別采用Agilent 1100色譜工作站、Phenomenex C18(150 mm×4.6 mm，3 μm)色譜柱和Waters e2695色譜工作站、Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱照“2.1”項下方法試驗測定有關物質和含量，5批樣品采用不同儀器、不同類型色譜柱試驗，結果基本一致，結果見表3和表4。

1. 雜質Ⅰ 2. 雜質Ⅱ 3. 雜質Ⅲ 4. 雜質Ⅳ 5. 雜質Ⅴ 6.雜質Ⅵ圖3 醋酸環丙孕酮及已知雜質Ⅰ～雜質Ⅵ混合溶液色譜圖表3 樣品有關物質測定及耐用性試驗結果

樣品編號有關物質測定結果(%)雜質Ⅰ單雜總雜耐用性試驗結果(%)雜質Ⅰ單雜總雜10.0130.080.110.0180.070.1120.0150.080.120.0180.070.1230.110.060.330.110.050.3440.090.030.230.100.020.2250.090.030.230.090.030.22

表4 樣品含量測定及耐用性試驗結果

3 討論

3.1本次醋酸環丙孕酮質量研究工作主要是在國標和《歐洲藥典》的方法基礎上對色譜系統進行了優化。其中國標方法系統適用性試驗醋酸甲羥孕酮與醋酸環丙孕酮的分離度應大于3.0，僅控制雜質總量；而EP 9.4(BP 2018)有關物質方法分別采用了混合雜質對照品(含有雜質F和雜質I)和雜質定位對照品(含有雜質B、雜質C、雜質E和雜質G)，對上述已知雜質的定位采用了兩種混合雜質對照品結合相對保留時間的方式。國標方法的分離度較差，無法將已知雜質完全分離。EP 9.4的測定方法可將6個已知雜質與主峰完全分離，但需要使用特殊型號色譜柱(C18，125 mm×4.6 mm，3 μm)且分析時間過長；而本品的已知雜質對照品國內尚無法生產，購買周期長，價格極其昂貴，不適用于常規檢驗。經修訂后的色譜系統僅用普通C18柱即可實現醋酸環丙孕酮及6個已知雜質對照品的完全分離，通過所采集的主峰和已知雜質對照品色譜圖及相對保留時間實現對已知雜質的定位。

3.2在進行堿破壞試驗中，首先選擇精密稱取本品約0.2 g，加乙腈15 ml使溶解，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液15 ml回流1 h，放冷，滴加1 mol/L鹽酸溶液至中性，轉移并加流動相至100 ml，結果主峰被完全降解。在多次調整破壞條件后發現，本品在堿性條件下極不穩定，常溫放置5 min即可發生降解，經比對，主要降解產物的保留時間及光譜圖與雜質Ⅲ一致，提示本品對堿性條件極不穩定。