地龍抗血栓肽分離研究

王佳茜，王少平，劉萬卉

(1.煙臺大學藥學院，山東 264000； 2.煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東 264000； 3.濱州醫學院，山東 264000)

地龍為巨蚓科動物參環毛蚓Pheretimaaspergillum(E Perrier)、通俗環毛蚓PheretimavulgarisChen、威廉環毛蚓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)或櫛盲環毛蚓PheretimapectiniferaMichaelsen 的干燥體，前一種習稱“廣地龍”，后三種習稱“滬地龍”[1-4]，具有清熱定驚，通絡，平喘，利尿的功效。用于高熱神昏，驚癇抽搐，關節痹痛，肢體麻木，半身不遂，肺熱喘咳，尿少水腫，高血壓等病癥[5-8]。

地龍中的主要成分為蛋白質，其含量占總蟲體的50%。地龍多為口服給藥，其中的蛋白質無法直接消化進入人體，需要進行體內酶解成小分子多肽才能被人體吸收并發揮作用[9-12]。因此本試驗模擬人體消化原理對地龍進行酶解得到地龍酶解液，同時采用多種方法對地龍酶解液進行分離，得到活性強、純度高的組分。

1 儀器與試藥

1.1儀器 BPH-9082型精密恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)，HH-601超級恒溫水浴鍋(鎮江瑞祥儀器有限公司)，MS104型十萬分一天平、MS105DU萬分之一天平(梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司)，KQ2200DV型超聲振蕩儀(杭州法蘭特超聲波科技有限公司)，DKH-43型實驗室用膜處理設備(上海陶氏膜處理集團)、LG1100型蠕動泵(dragonlab儀器公司)，DA201-C、D101、AB-8大孔吸附樹脂(滄州寶恩樹脂有限公司)、sephadex G15、sephadex G25、G50、Agilent BOZAX300SB-C18肽色譜柱(150 mm，5 μm)、C18半制備色譜柱(250 mm×50 mm，10 μm)，以上色譜柱購自濟南華哲實驗儀器有限公司，TSK-GEL G2000SWXL凝膠色譜柱(300 mm，5 μm，125 ?)、RP-kromasilo C18色譜柱，以上色譜柱購自日本TSK公司，1 000 Da納濾膜、3 000 Da超濾膜、燒杯(規格：10、100、1 000和5 000 ml)，量筒(規格：10 和100 ml)，培養皿(直徑10 cm)，試管(0.5 cm×10 cm)，玻璃棒。

1.2試劑 凝血酶(批號20150610，活力：500 U/g，深圳生化制劑廠)，瓊脂糖(批號20151102，國藥集團化學試劑有限公司)，牛血纖維蛋白原(純度95.3%，批號20140103，沈陽拜英生物科技有限公司)，牛血清白蛋白BSA(純度：99.9%，國藥集團化學試劑有限公司)，注射用尿激酶(活性：30萬U/g，遼寧天正生物制藥有限公司)，生理鹽水(500 ml，山東華魯制藥集團)，分子量測定標準物質(BSA66430、血管緊張素1 045.5、低分子肝素鈉3 700、乙酰胺乙酰胺乙酸189.1)購自上海源葉生物科技有限公司,磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸銅、硫酸鋰、鎢酸鈉、氫氧化鈉、碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、磷酸、鉬酸鈉、鹽酸均為分析純，去離子水(實驗室自制，密理博水處理系統)。

2 方法與結果

2.1纖維平板纖溶試驗

2.1.1試劑配制

2.1.1.1磷酸(PBS)緩沖溶液制備 稱取磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉適量，加入適量去離子水，制成pH為7.2的磷酸緩沖溶液。

2.1.1.2工作液 將生理鹽水和配好的PBS溶液按照17∶1的比例配制工作液。

2.1.1.3牛纖維蛋白原溶液 取0.3 g牛纖維蛋白原，加工作液100 ml，配制成0.3%的牛纖維蛋白原溶液。

2.1.1.4凝血酶溶液 取凝血酶1.0 g，加生理鹽水制成10 U/ml的溶液。

2.1.1.5尿激酶溶液 取30萬U/g的尿激酶，加生理鹽水，分別配制成100 000、50 000、10 000、1 000、500和100 U/ml的溶液。

2.1.2標準曲線建立 取工作液100 ml，采用電熱套對其加熱煮沸，加入0.5 g瓊脂糖，待其徹底溶解后，取出，放涼至50 ℃，加入20 ml牛纖維蛋白原溶液、1.0 ml 10 U/ml凝血酶溶液，振蕩后導入培養皿內部，每個培養皿10 ml，放入4 ℃冰箱冷藏15 min。用直徑為1 mm打孔器進行打孔，并在每個孔內加入“2.1.1.5”項下各尿激酶標準溶液10 μl，放入恒溫培養箱培養12 h(37 ℃)。取出后采用游標卡尺對溶圈進行測定，計算溶圈面積。以溶圈面積為縱坐標，以尿激酶活力(U)的對數為橫坐標進行線性回歸。 得到線性方程為Y=1.560 2X-1.833 1(R2=0.996 4)，結果尿激酶活性在100～50 000 U范圍內線性良好。

2.2多肽標準曲線

2.2.1對照品溶液 精密稱取牛血清白蛋白10 mg，加去離子水溶解，而后轉移至50 ml量瓶中定容，備用。

2.2.2堿性銅試液配制 精密稱取烘干后的NaOH 10.0 g、Na2CO350 g，加水400 ml溶液，作為A液；再取酒石酸鉀鈉0.5 g、五水硫酸銅0.25 g，加水80 ml溶解，作為B液。使用時A液、B液混合定容至500 ml即得堿性銅試液。

2.2.3福林酚試液配制 取鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)50 g、鉬酸鈉12.5 g，加水500 ml置于2 000 ml圓底燒瓶內，再加入35%磷酸溶液25 ml、鹽酸(質量分數為38.5%)50 ml，然后置于加熱套內冷水回流加熱，沸騰后計時，保持微沸10 h，再加硫酸鋰25 g、去離子水50 ml，搖勻，再加0.2 ml溴，敞口加熱揮發多余的溴，保持沸騰15 min，放涼，倒出，過濾，置于棕色量瓶內，定容至500 ml，備用。

2.2.4標準曲線建立 精密量取對照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 ml，分別置具塞試管中，各加水至1.0 ml，再分別加入堿性銅試液1.0 ml，搖勻，各加入福林酚試液[取福林試液儲備液(1→16)]4.0 ml，立即混勻，置55 ℃水浴中反應5 min，取出，置冷水浴中冷卻10 min，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2015年版一部附錄Ⅴ A)，以0號管為空白，在650 nm波長處迅速測定吸光度。以吸光度為縱坐標，牛血清白蛋白含量為橫坐標，繪制標準曲線，并計算線性回歸方程。線性回歸方程為Y=2.028 3X+0.008 6(R2=0.999 1)，表明肽在0～0.2 mg/ml范圍內線性良好。

2.3樣品制備與處理

2.3.1酶解液制備 取地龍藥材(粉粹、過80目篩)100 g，加去離子水1 000 ml，先加熱煎煮20 min，然后加0.1 mol/ml HCl溶液調pH至1.5，再加入胃蛋白酶1.0 g，37 ℃保溫酶解1.0 h，而后再加2%NaOH溶液調pH至8.0，加胰蛋白酶1.0 g，繼續酶解2.0 h，酶解完成后煮沸20 min，放涼，冷藏12 h，離心(4 500 r/min) 10 min，收集離心液，濃縮至500 ml。

2.3.2酶解液脫鹽處理 調整地龍酶解液濃度到500 mg/ml，調pH至6.5，分別裝入電滲析儀器內，先在流速15 L/h下平衡裝置15 min，連通電源，在電壓31 V條件下進行除鹽操作，操作時間為150 min。采用電導儀進行測定得出脫鹽率為95%。

2.4地龍活性肽分離

2.4.1超濾分離 采用3 000 Da、1 500 Da超濾膜對“2.3.2”項下的地龍酶解脫鹽液進行超濾處理，設定壓力為0.3 Mpa，流速為20 L/h，同時采用恒容間歇方法進行試驗，將地龍酶解脫鹽液分為<1 500 Da、1 500～3 000 Da和>3 000 Da 3種溶液。分別標記為L1、L2和L3。調整L1、L2、L3溶液質量濃度至5 mg/ml，采用“2.1”項下纖溶試驗對3種溶液進行活性測定，得出體外纖溶活性結果，見表1。結果表明，體外纖溶活性大小順序為L1>L2>L3。因此選用L1即<1 500 Da溶液進行下一步分離。

表1 超濾溶液活性結果(n=5)

2.4.2DA201-C樹脂分離

2.4.2.1DA201-C樹脂預處理 取DA201-C樹脂適量，先加去離子水，充分浸泡12 h，過濾，反復幾次，直至溶液無顏色變化為止。然后加95%乙醇浸泡12 h，過濾，反復幾次，直至乙醇溶液無顏色變化為止，再使用去離子水沖洗至無醇味，備用。

2.4.2.2樹脂吸附 將與處理好的DA201-C樹脂裝入樹脂柱，然后將地龍酶解液<1 500 Da溶液調整濃度至20 mg/ml，調節pH至6.0，以2 BV/h的流速上樣，下端接電腦自動收集器，每5 ml收集一試管，以A220 nm≤0.05為上樣終點，靜態吸附3 h后，采用去離子水、30%乙醇、50%乙醇和80%乙醇分別對吸附后的DA201-C樹脂進行洗脫。分別收集洗脫液，濃縮，調整質量濃度至5 mg/ml。

2.4.2.3活性測定 采用“2.1”項下纖溶試驗對4種洗脫溶液進行活性測定，得出體外纖溶活性結果。見表2。結果表明，30%乙醇洗脫液洗脫液纖溶活性最強，因此下一步對30%乙醇洗脫液進行分離。

2.4.3G15凝膠分離

2.4.3.1G15 sephadex凝膠預處理 取G15凝膠樹脂，采用去離子水洗滌，過濾，去掉雜質后，再次采用去離子水充分浸泡24 h，備用。

表2 DA201-C樹脂洗脫液活性結果(n=5)

2.4.3.2G15凝膠樹脂分離 取G15凝膠樹脂，裝入樹脂柱內，將過DA201-C樹脂的30%乙醇洗脫液濃縮至10 mg/ml，從樹脂柱上端裝入，上樣體積2 ml，上樣后隨即采用去離子水進行洗脫。下端接樣品電腦自動收集器，每1 ml收集一個試管，在280 nm下檢測每個試管的吸光度并記錄，繪制以試管數為橫坐標，試管吸光度為縱坐標的曲線。結果見圖1。

從圖1可以看出，G15將30%乙醇洗脫液分為兩個部分，第一部分為試管7～14，第二部分為試管15～30，因此重復上述分離步驟50次，分別收集兩個峰，分別命名為P1和P2。調整質量濃度為5 mg/ml，然后按照“2.1”項下纖溶試驗對P1、P2進行活性測定，得出體外纖溶活性結果，見表3。

試管數圖1 G15吸附結果圖表3 G15分離樣品活性結果

樣品活性(U/g)P15 002.134 8±89.003 4P223 485.290 1±154.394 5

表3結果得出，G15分離得到的P1、P2活性大小為P2>P1，因此下一步對P2進行分離。

2.4.4液相分離 地龍酶解液采用超濾、DA201-C樹脂、G15凝膠分離后得到活性較高的P2組分，為進一步了解P2起纖溶活性的物質，采用液相對P2組分進行進一步分離。

色譜條件：色譜柱：waters -C18肽色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：220 nm；流速：1.0 ml/min；檢測器：UV檢測器；流動相：采用梯度洗脫方法：A:0.1%TFA乙腈，B：0.1%TFA水，0～55 min：95%B→50%B；55 min～75 min：50%B→95%B；進樣量：20 μl。按照以上色譜條件進行試驗。結果見圖2。

圖2 色譜對P2組分的分離結果

根據圖2所示，液相將P2組分分為5個主要峰，分別命名為F1、F2、F3、F4和F5，說明分離效果良好。因此按照上述液相條件采用半制備液相對組分P2進行半制備分離，分離得到F1、F2、F3、F4和F5樣品，濃縮至質量濃度為2 mg/ml。并按照“2.1”項下體外纖溶活性試驗對5個樣品進行測定，結果見表4。結果5個組分的活性順序為F3>F2>F1>F5>F4，說明F3組分為主要的活性成分。

采用Waters半制備液相對P2樣品進行半制備，重復100次，接收F3組分，采用“2.1”、“2.2”項下方法對F3組分進行多肽含量、纖溶活性試驗，得出多肽含量為95.13%，纖溶活性為60 021.302 9 U/g。

表4 5個組分活性結果

3 討論

本試驗以地龍為試驗材料，結合人體對大分子蛋白的消化原理設計體外酶解方法對地龍藥材進行體外酶解，得到地龍活性酶解液。同時采用電滲析、超濾、DA201-C樹脂、saphedexG15凝膠樹脂、液相進行分離，得到純度高、活性強的組分F3。同時采用Waters半制備液相對F3進行半制備，然后對F3進行多肽含量與活性測定，得出F3多肽含量為95.13%，纖溶活性為60 021.302 9 U/g。

地龍作為傳統中藥具有活血化瘀的功效，現代研究得出，地龍中的活性成分為蚓激酶，蚓激酶為兩種類型酶，即纖維蛋白溶酶原激活物和纖維蛋白溶酶；其中還有類似組織型纖維蛋白溶酶原激活物(t-PA)的成分。但是大分子蛋白并不能直接通過腸道被人體吸收，因此酶解后形成小分子肽才能更好地發揮藥效作用。由于酶的位切點存在多樣化，因此造成酶解多肽存在多個序列形成混合物。因此試驗采用多種方法在多肽混合物中尋找活性較強的組分。后期試驗將對F3采用LC-TOF2-MS、500 M核磁共振儀進行結構的分析。