酒精依賴和肌萎縮側索硬化因果關系的孟德爾隨機化分析*

徐州醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室(221004)

黃林玉 王鳴岐 余星皓 曾 平△ 黃水平△

【提 要】 目的 采用孟德爾隨機化方法探索飲酒行為和肌萎縮側索硬化發病風險的因果關系。方法 利用大樣本全基因組關聯研究數據，確定與酒精依賴密切相關的遺傳位點作為工具變量，通過逆方差加權法、MR-Egger回歸法等兩樣本孟德爾隨機化方法，以比值比(OR值)作為結局指標對因果關系進行評價。結果 本研究共納入476例男性酒精依賴患者和1358例男性對照，IVW方法估計的OR值為1.12(95%可信區間：1.02-1.24，P=0.021)，MR-Egger回歸結果表明遺傳多效性不會對結果造成偏倚(截距=-0.036，P=0.755)。結論 本研究采用兩樣本孟德爾隨機化的方法，表明在男性中嚴重的酒精依賴會增加肌萎縮側索硬化的風險。

肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，俗稱“漸凍癥”，是一種致命的退行性神經疾病，歐洲人群年發病率約為2～3/10萬，且男性患者多于女性[1]。ALS初期臨床表現為肌束震顫、吞咽和講話困難；隨病程進展，運動神經元發生不可逆的程序性凋亡進而導致全身肌肉萎縮，患者逐漸失去運動能力，最終往往因呼吸系統衰竭而窒息死亡；中位生存期約為3年[2-3]。目前暫無針對ALS的有效臨床診斷及治療方法；利魯唑是目前唯一一個美國食品藥品管理局批準用于治療ALS的藥物，但僅能延長患者3～6個月的生存期[4-5]。

在所有ASL病例中，約有10%的ALS顯示家族聚集性的特點，而其余90%為散發病例。ALS的致病機制和病因尚未明確，遺傳因素和環境因素都會影響ALS的發展，其中20%的病例可能與遺傳和基因缺陷有關。目前已研究發現30多種ALS相關致病基因[6]，主要包括SOD1[7]，TDP43和C9orf72。流行病學研究表明，吸煙、飲酒等行為因素[8-11]以及重金屬中毒[12]等環境因素都和ALS存在一定關聯。

識別ALS的病因對其預防、診斷和治療至關重要。傳統的觀察性流行病學方法，如病例對照研究、隊列研究，可用來探索復雜疾病的病因，但往往受到反向因果關聯及潛在混雜因素(如，吸煙、飲酒和飲食等)的影響，從而影響其論證病因假設的能力。隨機對照試驗(randomized controlled trial，RCT)因其可比性好、因果關聯時序合理、有效控制偏倚的優點，被視為檢驗因果關系的“金標準”[13]。然而，RCT難以控制樣本的代表性，需要大量的人力物力及財力，且經常受到倫理學限制，因而實際中實施難度較大。

1986年，學者Katan[14]提出了孟德爾隨機化(Mendelian randomisation，MR)的概念，具體思想是：配子在形成過程中遵循孟德爾隨機分配定律，即親代等位基因隨機分配給子代；如果基因型決定表型，基因型可通過表型與疾病發生關聯，因此可以使用基因型作為工具變量[15](instrumental variable，IV)來推斷表型與疾病之間的因果關聯。MR是一種在觀察性研究中以IV為基礎進行因果推斷的方法，與中間表型或環境暴露有關聯的遺傳變異可以作為中間變量，來估計暴露對疾病結局的影響。由于基因是人類一出生即決定的，因此不會受到后天的環境因素、生活方式、行為因素等常見的混雜因素的影響；且符合因果判定中“先因后果”的時序性要求，可以有效避免反向因果關聯的干擾[16]。但是，MR的應用需要滿足三個前提假設[17]：(1)作為IV的遺傳變異與待研究的暴露因素密切相關；(2)IV與已知的混雜因素不存在關聯；(3)IV和疾病結局無直接關聯，即IV除了通過暴露因素以外，不可以通過其它途徑來影響疾病結局(見圖1)。近年來，大樣本的全基因組關聯研究(genome-wide association study，GWAS)的廣泛應用和公共數據的公開，使得通過MR來廣泛研究不同暴露和ALS的因果關聯成為可能[18]。

圖1 多個工具變量孟德爾隨機化的圖模型*實線表示存在關聯，虛線表示不存在關聯

作為一個常見的生活行為暴露，飲酒與ALS的關系引起了廣泛關注。先前一項大型瑞典國家隊列研究的結果表明[11]，患有酒精使用障礙的人群和未患有酒精使用障礙的對照組相比，ALS的發病風險明顯降低，標化發病率為0.54[95%可信區間(confidence interval，CI)：0.45～0.63，P=7.04×10-14]。有兩項基于人群的病例對照研究表明，高酒精攝入和ALS風險降低有關，優勢比(odds ratio，OR)分別為0.91(95%CI：0.84～0.99，P=0.03)[19]和0.52(95%CI：0.40～0.75，P=4.54×10-5)[10]。一項包括5個觀察性研究的關于酒精消耗與ALS的meta分析表明[20]，飲酒可降低患ALS風險(OR=0.57，95%CI：0.51～0.64，P=2.88×10-22)。這些觀察性研究的結果暗示酒精對ALS可能具有潛在的神經保護作用。然而，也有研究表明飲酒可能增加ALS的潛在發病風險。例如，有兩項關于日本人群和新西蘭人群的病例對照研究報告飲酒和ALS發病風險的OR值分別為1.10(95%CI：0.70～1.50，P=0.62)[21]和1.10(95%CI：0.50～2.50，P=0.82)[22]，但這種關聯在調整吸煙的混雜后不存在統計學意義。此外，最近的一項meta分析[23]證實飲酒和ALS風險之間不存在關聯。從上可見，目前尚不清楚飲酒與ALS之間是否存在因果關系。因此，本文嘗試通過MR來探索飲酒與ALS的關系，并估計其效應大小。

研究設計及方法

1.研究設計

本研究采用兩樣本MR[24]作為估計酒精依賴和ALS發病風險因果關系的方法。兩樣本MR研究是以最早的一階段MR研究為基礎發展形成的。所謂兩樣本，即在一個樣本獲得GWAS與酒精依賴(暴露因素)的關聯數據，確定與酒精依賴密切相關的遺傳變異；通過另一個樣本獲得GWAS與ALS(疾病結局)的關聯數據，再結合與酒精依賴相關聯的遺傳變異，進而確定可以作為工具變量的遺傳變異(即與酒精依賴和ALS均密切相關的遺傳變異)。兩樣本MR要求兩樣本相互獨立，來自同一人群，具有相似的性別、年齡以及種族特征。任何一種遺傳變異類型都可以作為IV，本研究選擇單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點作為工具變量類型。

2.數據來源

以2009年發表在Archives of General Psychiatry上的一項關于酒精依賴的GWAS作為酒精依賴遺傳變異的數據庫[25]。該項研究共包括476個男性病例和1358個男性對照，所有個體均為德國人，以美國精神障礙診斷統計手冊(DSM-IV)的標準來定義酒精依賴，符合嚴重酒精依賴且發病年齡早于28歲者納入病例組；數據庫中共包括524396個SNPs，其中有8個SNPs和酒精依賴密切相關(P<1×10-5)。需要說明的是，通常當SNP的P<5×10-8的臨界值時才具有全基因組意義；但若以P<5×10-8作為篩選標準，在該數據庫中僅有3個SNP符合，且彼此之間存在連鎖不平衡。有研究表明，在對風險因素的每個遺傳變異進行線性回歸后，若P<1×10-5，則MR分析存在弱工具變量偏倚的可能性很小(即不違反MR應用的第一項假設)[26]，故而本研究采用P<1×10-5作為臨界標準并確定了8個和酒精依賴密切相關的SNP，提取需要的數據信息，包括每個SNP的rs編號、主要和次要等位基因，以及等位基因頻率、β系數、P值和標準誤。

關于ALS的基因型數據來自于2017年對ALS的一項GWAS分析[27]，包括12577例ALS患者和23475例健康對照，所有個體均為歐洲血統。數據庫中包括7740344個與ALS有關的遺傳變異。在ALS基因型數據庫中篩選和酒精依賴密切相關的8個SNP，最終確定了7個和酒精依賴、ALS均存在關聯的具有全基因組意義(P<1×10-5)的SNPs作為工具變量。但是，有3個SNPs兩兩之間存在明顯的連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)，分別是rs7590720、rs1344694及rs705648(rs1344694-rs7590720：r2=0.739；rs1344694-rs705648：r2=0.568；rs7590720-rs705648：r2=0.776)。為避免LD對因果估計結果造成偏倚及過度估計，本研究依次納入3個SNP的其中之一進行MR分析，即每次分析有5個SNP作為遺傳工具變量。本文所有的統計分析均在R軟件3.4.4版本中進行。

3.兩樣本MR方法

(1)Wald比值和逆方差加權法估計效應

IVW模型(inverse-variance weighting，IVW)是一種加權線性回歸模型，所謂逆方差加權，是聚集兩個或多個隨機變量的方差總和并使之最小化的一種方法，且每個隨機變量與它的方差成反比：

(2)敏感性分析

Egger′s檢驗常用來定量評價meta分析中發表偏倚的大小，用回歸方程的截距來表示[28]。在MR分析中，采用多個SNP作為工具變量，這樣就難以避免遺傳多效性對因果估計產生影響，使用MR-egger回歸可以評價遺傳多效性帶來的偏倚，MR-Egger回歸直線的截距說明了定向多效性的大小[29]。若回歸方程的截距接近于0，則認為遺傳多效性影響較小。使用MR-Egger回歸的前提是要滿足InSIDE假設，即遺傳變異-暴露因素和遺傳變異-疾病結局之間的影響是相互獨立的[30]。采用meta分析中“leave-one-out”的敏感性分析方法，每次分析剔除一個SNP，將其作為測試集，剩余的SNP作為訓練集。若研究中使用非特異性SNP作為IV，即同時與目標暴露因素和其他暴露因素均存在關聯的SNP，可能會對因果估計效應產生影響，而敏感性分析可以評價非特異性SNP對因果關聯估計結果的影響大小。

結 果

1.工具變量SNP信息

表1列出了用于MR分析的7個遺傳工具變量的相關信息，包括染色體位置、效應等位基因及其頻率、與酒精依賴關聯的β系數及其標準誤、與ALS的關聯β系數及其標準誤。每個SNP的Wald比值及其95%置信區間的森林圖見圖2。圖2展示了既往飲酒與ALS關系的觀察性研究結果，Ji 2016表示瑞典人群隊列研究結果[11]；Meng 2016表示一項關于歐洲人群meta分析的結果[20]；Huisman 2015表示一項荷蘭人群的病例對照研究結果[19]。

圖2 工具變量SNP及三項既往關于飲酒與ALS關系的研究結的OR值及其95%CI森林圖

*IVW effect1、MR-Egger effect1表示：rs1344694納入研究；IVW effect2、MR-Egger effect2表示：rs7590720納入研究；IVW effect3、MR-Egger effect3表示：rs705648納入研究

表1 工具變量SNP信息列表

*：Chr：染色體；BP：堿基對位置；EA：效應SNP的等位基因；MAF：效應SNP的等位基因頻率；AD：酒精依賴；SE：標準誤；ALS：肌萎縮側索硬化。

2.IVW法結果

將rs1344694、rs7590720、rs705648OR分別納入研究，OR值分別為1.10(95%CI：1.00～1.22，P=0.062)、1.11(95%CI：1.01～1.22，P=0.027)、1.12(95%CI：1.02～1.24，P=0.021)，表明酒精依賴會提高ALS的發病風險約為10%。

3.敏感性分析結果

將rs1344694、rs7590720、rs705648分別納入研究，MR-Egger回歸的OR值分別為1.17(95%CI：0.47～2.93，P=0.739)、1.16(95%CI：0.54～2.48，P=0.706)、1.30(95%CI：0.53～3.16，P=0.573)，截距分別為-0.016(95%CI：0.12～0.25，P=0.897)、-0.011(95%CI：0.10～0.21，P=0.918)、-0.036(95%CI：0.12～0.26，P=0.755)，截距都很小，接近于0，且P值均大于0.05，說明遺傳多效性不會對因果效應造成偏倚。

敏感性分析結果見表2、表3及表4，結果表明，每次MR分析中，即使將和酒精依賴關聯最為密切的上述3個SNP依次移除研究，OR仍為1.11(95%CI：1.01～1.21，P=0.02)，說明不存在會對因果估計結果產生影響的非特異性SNP。

表2 rs1344694納入研究的敏感性分析

表3 rs7590720納入研究的敏感性分析

表4 rs705648納入研究的敏感性分析

討 論

本研究借助大規模GWAS，利用MR研究了酒精依賴和ALS的關系，結果表明男性酒精依賴和ALS之間存在因果關聯，嚴重的酒精依賴會提高ALS的發病風險。據我們所知，本研究是首次對酒精依賴和ALS進行因果關系估計的MR評價。MR研究進行因果推斷的優點在于遺傳變異是長期而穩定的暴露因素，且可以直接測量，不受社會環境、生活方式等混雜因素的干擾。和RCT相比，MR可以嚴格控制樣本代表性并將其隨機分配到各個觀察組。本研究采用的兩樣本MR研究，基于現有的公開GWAS數據，樣本量較大，可以獲得更大的把握度，經濟且高效。

先前的觀察性研究[10-11,19-20]顯示酒精可能具有潛在的神經保護作用而本研究暗示了飲酒對ALS的潛在風險，其機制可能與膠質纖維酸性蛋白以及酒精的神經毒性有關。有學者進行了動物實驗，在一項大鼠實驗中，酒精組和對照組相比，星形膠質細胞中的GFAP密度降低[31]。而在ALS的發展過程中，一個明顯特征就是反應性星形膠質細胞中的膠質纖維酸性蛋白的表達增加[32]。但是，神經毒性物質谷氨酸堆積在神經細胞之間對ALS有很大影響，過量的谷氨酸能直接破壞運動神經細胞。已有研究表明，長期大量飲酒可介導谷氨酸離子型受體N-methy1-D-aspartat(NMDA受體)，造成細胞間隙谷氨酸鹽的大量堆積，導致細胞遲發型損傷[33]，這一結論也支持了本研究的結果。

本研究也具有一定的局限性，首先，兩樣本MR分析使用的是GWAS的匯總數據，目前還無法檢測暴露因素和疾病結局之間的非線性關系，也無法進行女性亞組(或男女總體人群)分析；例如，通常男性與女性在飲酒行為方面存在較大差異且ALS的發病存在性別差異，進行不同性別的MR分析可獲得更加具體的效應關系。本研究對嚴重的酒精依賴與ALS之間的因果關系進行估計，但是，由于缺少分組數據，無法探索輕度或中度酒精依賴是否與ALS也存在因果關聯，也無法研究不同飲酒種類(例如，紅酒、烈酒或啤酒)是否與ALS也存在因果關聯。其次，兩樣本MR假定兩個樣本來自相同的人群且沒有重疊。若兩樣本來自不同的人群，估計的因果效應大小可能存在偏倚。在本研究中，確保兩樣本人群均為歐洲血統的個體，以減少種族偏倚的影響。此外，兩樣本MR分析無法對發病機制進行解釋，因此還需要進一步探索飲酒對ALS致病機制。

總之，本研究采用兩樣本孟德爾隨機化的方法，對酒精依賴和肌萎縮側索硬化進行因果關系推斷，認為男性中嚴重的酒精依賴會導致ALS患病風險增加。