單純性肥胖兒童體循環miRNA表達變化及相關性分析

劉祖霖?侯樂樂?孟哲?張麗娜? 江轉南?梁立陽

【摘要】目的 了解單純性肥胖兒童體循環微小RNA（miRNA）表達變化的特點，分析其與肥胖相關指標的關系。方法 選取8 ～ 10歲單純性肥胖兒童18例設為肥胖組，年齡分布、性別組成比例一致的正常體質量兒童18名設為正常對照組，測量體格數據及生化指標。2組均隨機選取3例個體行miRNA基因芯片檢測，篩選差異性miRNA，剩余15例行miRNA驗證，并分析差異性miRNA表達量與體格數據、生化指標的相關性。結果 基因芯片篩選出表達差異的miRNA 67個，通過靶基因預測挑選miRNA-142-3p、miRNA-142-5p、miRNA-133b、miRNA-486-3p進行驗證。肥胖兒童體循環中miRNA-142-5p表達上調，且表達量與體質量、腰圍、腰圍/身高、BMI、血壓、甘油三酯、總膽固醇、非HDL呈正相關，與胰島素敏感指數（ISI）呈負相關（P均 < 0.05）。miR-133b表達下調，且表達量與體質量、腰圍、腰圍/身高、BMI等指標呈負相關，與ISI呈正相關（P均 < 0.05）。結論 單純性肥胖兒童體循環中miRNA的表達譜與正常兒童存在差異，且與代謝異常相關;miRNA有望成為篩查肥胖兒童、代謝綜合征易患人群的分子標志物。

【關鍵詞】兒童;單純性肥胖; 微小核糖核酸

Changes in expression of circulating miRNAs and correlation with obesity-related parameters in children with simple obesity Liu Zulin， Hou Lele， Meng Zhe， Zhang Lina， Jiang Zhuannan， Liang Liyang. Department of Pediatrics， Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China

Corresponding author， Liang Liyang， E-mail： doctorlly@ 126. com

【Abstract】Objective To investigate the changes of the expression of circulating microRNAs （miRNA） in children with simple obesity， and explore the correlation with obesity-related parameters. Methods Eighteen children with simple obesity， aged 8-10 years old， were assigned into the obesity group and 18 age-and gender-matched healthy children were enrolled in the control group. Morphometric data and biochemical parameters were quantitatively measured. In both groups， 3 chidlren were randomly selected for miRNA array to screen differential miRNA. The remaining 15 cases were subject to miRNA verification. The correlation between the expression levels of differential miRNA， and morphometric data and biochemical parameters was analyzed.? Results A total of 67 differential miRNAs were screened. Through prediction of target genes， miRNA-142-3p， miRNA-142-5p， miRNA-133b and miRNA-486-3p were selected for miRNA verification. The expression of miRNA-142-5p was up-regulated in children with simple obesity， which was positively correlated with body weight， waist circumference， waist-to-height ratio， body mass index （BMI）， blood pressure， triglyceride， total cholesterol， non-high density lipoprotein， whereas negatively correlated with insulin sensitivity index （ISI） （all P < 0.05）. The expression level of miRNA-133b was down-regulated， which was negatively correlated with body weight， waist circumference， waist-to-height ratio and BMI， whereas positively correlated with ISI （all P < 0.05）. Conclusions The expression profile of circulating miRNA differs between children with simple obesity and healthy counterparts， which is associated with metabolic disorders. Hence， miRNA might serve as a molecular marker for screening of children with obesity and high-risk metabolic disorders.

【Key words】Child;Simple obesity;microRNAs

微小RNA（miRNA）是指廣泛存在于真核生物體內的一組具有調控mRNA表達功能、長約19 ～ 25核苷酸（nt）的小分子非編碼RNA，其與靶基因以堿基互補配對方式形成沉默復合體，發揮影響mRNA穩定性、抑制mRNA翻譯并促進其降解的作用，具有時序性、組織特異性等生物學特性[1]。近年有研究顯示miRNA在脂肪細胞分化、糖脂代謝、胰島素信號通路等代謝過程中發揮重要調控作用[2] 。然而筆者查閱文獻發現目前世界范圍內關于單純性肥胖兒童體循環中miRNA表達變化的研究不多，且多處于統計描述階段;另外肥胖兒童體循環中miRNA表達水平與體質量、腰圍、BMI等體格測量數據及血脂、血糖、胰島素等生化指標關系的分析缺乏大樣本的數據支持。因此，本課題組擬以健康兒童的外周血樣本為參考，對單純性肥胖兒童體循環miRNA水平進行分析，以進一步探究miRNA作為兒童肥胖相關代謝異常的分子標志物的可能性。

對象與方法

一、研究對象

選取2011年8月至2017年4月于我院新確診且未進行干預的8 ～ 10歲的單純性肥胖兒童18例（男7例、女11例）設為肥胖組（單純性肥胖指BMI大于同年齡、同性別第95百分位數，且除外繼發性肥胖），將同期到我院進行入學體檢的性別、年齡相匹配的正常兒童18名（男9名、女9名）設為正常對照組。分別隨機抽取單純性肥胖與正常兒童各3例，將其血樣用于基因芯片篩查（miRNA初篩），各組其余15例血樣用于miRNA驗證。所有入選對象均排除繼發性肥胖、自身免疫性疾病、家族遺傳性疾病、血液病、各種惡性腫瘤及近期有嚴重感染、重大外傷或手術等情況。

二、方 法

1. 人體參數測量

按照WHO兒童身高體質量測量方法2003標準測量所有兒童的身高、體質量、腰圍[3]。使用水銀血壓計測量所有兒童的血壓，根據兒童上臂長度選擇適當袖帶，每例測量2次，取平均值。

2. 生化指標檢測

于空腹8 h后采集所有兒童的靜脈血用于檢測。使用雅培安妥超越型血糖儀測定血糖，采用的是葡萄糖氧化酶電極測量法。使用日立7600全自動生化分析儀以直接化學發光免疫分析法測定總膽固醇、HDL、非HDL（non-HDL）、LDL、甘油三酯、胰島素。

3. 基因芯片檢測及逆轉錄-PCR（RT-PCR）驗證

本部分研究委托廣州金域檢驗公司完成。基因芯片采用高通量microRNA microarray技術，使用μParaflo 微流體芯片，miRNA的標記與芯片的雜交使用Cy3染料染色。雜交圖像利用激光掃描儀（GenePix 4000B，Molecular Device）采集，并使用Array-Pro 圖像分析軟件（Media Cybernetics）進行圖像數字化轉換。驗證使用實時熒光PCR儀（Bio-Rad CFX96）完成。

4. 目標miRNA選擇方法

使用生物信息學分析軟件對篩選出的表達差異倍數較高的miRNA進行靶基因預測，挑選目標miRNA進行驗證。使用的生物信息學分析軟件包括：第一代預測軟件miRanda、TargetScans，第二代測序軟件PicTar、microTar以及數據庫miRBase。采用5種軟件分別進行靶基因預測，后取交集。靶基因參與糖脂代謝、胰島素信號通路或脂肪細胞分化等過程，即可作為目標miRNA。

三、統計學處理

應用SPSS 24.0進行統計分析。非正態分布定量資料采用中位數（下四分位數，上四分位數）描述，組間比較采用秩和檢驗。2組定性數據的比較采用Fisher確切概率法。各指標間相關性采用Spearman秩相關分析。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、 基因芯片檢測及目標體循環miRNA選擇

本研究共檢測循環miRNA 1895個，篩選出存在統計學意義差異的miRNA 67個（差異2倍及以上），其中表達下調48個，表達上調19個，最大差異倍數9.02倍。通過靶基因預測，挑選miRNA-142-3p、miRNA-142-5p、miRNA-133b與miRNA-486-3p進行驗證，見表1。

二、RT-PCR驗證

miRNA-142-3p、miRNA-142-5p、miRNA-486-3p及miRNA-133b 男、女間比較差異無統計學意義（P均> 0.05），見表2。肥胖組血漿中miRNA-142-5p表達上調，miRNA-133b表達下調，而miRNA-142-3p和miRNA-486-3p的表達水平2組間無差異（P均> 0.05），見表3。

三、體循環miRNA-142-3p、miRNA-142-5p、miRNA-486-3p及miRNA-133b代謝異常差異性分析

miRNA-142-3p表達水平僅在中心性肥胖兒童中升高，而不受代謝異常影響;miRNA-142-5p表達水平在合并有高甘油三酯血癥、胰島素抵抗（IR）等代謝異常的兒童中表達升高，而不受中心性肥胖、血壓異常的影響; miRNA-133b表達水平不受代謝異常的影響;miRNA-486-3p表達水平在中心性肥胖及IR兒童中升高，不受高甘油三酯血癥、高血壓、高non-HDL血癥等代謝異常的影響，見表4。

四、miRNA表達水平相關性分析

分析體格測量數據及生化指標與miRNA-142-5p、miRNA-142-3p、miRNA-133b、miRNA-486-3p的相關性，結果顯示miRNA-142-5p表達水平與體質量、腰圍、腰圍/身高、BMI、血糖、血壓、甘油三酯、non-HDL、胰島素及胰島素抵抗指數（HOMA-IR）呈正相關，與胰島素敏感指數（ISI）呈負相關;而與年齡、總膽固醇、HDL、LDL等無相關性;miRNA-133b表達量與體質量、腰圍、腰圍/身高、BMI、胰島素、HOMA-IR等呈負相關，與ISI呈正相關，與年齡、血脂、血壓等無相關性;miRNA-142-3p表達水平與體格測量數據及生化指標均不存在相關性;miRNA-486-3p表達水平僅與血壓水平呈正相關，見表5。

表5? ? ? ?目標體循環miRNA表達水平的相關性分析

項 目 miRNA-

142-3p miRNA-

142-5p miRNA-

133b miRNA-

486-3p

年齡 -0.330 0.070 -0.067 -0.077

體質量 -0.300 0.482a -0.487a 0.155

腰圍 -0.349 0.452a -0.493a 0.180

腰圍/身高 -0.285 0.490a -0.434a 0.170

BMI -0.272 0.534a -0.443a 0.169

血糖 -0.317 0.491a -0.296 -0.182

收縮壓 -0.251 0.486a -0.300 0.401a

舒張壓 0.198 0.460a -0.033 0.350

甘油三酯 -0.047 0.374a -0.199 -0.061

總膽固醇 -0.366a 0.322 -0.106 -0.120

HDL 0.030 -0.020 0.167 0.170

LDL -0.182 0.223 -0.108 -0.133

non-HDL 0.287 0.362a -0.199 -0.099

胰島素 -0.282 0.578a -0.458a 0.085

HOMA-IR -0.200 0.590a -0.437a 0.092

ISI 0.253 -0.565a 0.466a -0.273

注：a為秩相關系數經檢驗P < 0.05

討論

miRNA作為基因表達調節的關鍵因子，幾乎參與生物體全部生命活動，從細胞的分化、發育、凋亡到機體的免疫應答、病毒感染、神經變性性疾病、腫瘤等，而且在脂肪細胞分化、糖脂代謝、胰島素信號通路等代謝過程中發揮著重要的調控作用[4-9]。循環中miRNA的表達變化與機體的生理病理狀態有關，并具有組織和疾病特異性，可以作為疾病的生物學標志物[2]。眾多研究顯示肥胖者與正常體質量者血漿中miRNA表達譜存在較大差異，并與體質量、腰圍等指標存在明確的相關性，并且隨體質量、BMI等指標的變化而改變，提示體循環miRNA可能是比血脂、胰島素、膽固醇等生化指標更能敏感預測肥胖及其并發癥的生物學標志物[2， 10-15]。

我們通過基因芯片初篩及RT-PCR驗證，最終發現4個目標miRNA在兒童循環中的表達水平不受性別差異的影響;與正常兒童相比，單純性肥胖兒童體循環中miRNA-142-5p表達上調，miRNA-133b表達下調，且其表達水平受代謝異常的影響，并與體格測量數據及生化指標存在明確相關性。

一、miRNA-142-5p、miRNA-133b與肥胖

miRNA-142-5p的靶基因包括ATP1B1和ACOX1， ATP1B1與Na+/K+ ATP酶的活性有關，參與調節胰島素分泌等生物過程[16]?；駻COX1編碼過氧化物酶酰基輔酶A氧化酶，通過影響脂肪酸β氧化，參與PPAR信號通路調節的方式來調節機體血脂、甘油三酯及酮體代謝等生物學過程[17]。本研究顯示與正常兒童相比，單純性肥胖兒童體循環中miRNA-142-5p表達上調，其在合并有高甘油三酯血癥、IR等代謝異常的兒童中表達升高，且其表達水平與體質量、腰圍、腰圍/身高、BMI、血糖、血壓、甘油三酯、non-HDL、胰島素及HOMA-IR呈正相關，與ISI呈負相關。miRNA-133b的靶基因包括TBL1X，參與調控脂肪細胞Wnt信號通路及脂肪細胞的分化。Wnt信號通路的激活，可以影響下游靶基因產物的磷酸化作用，進而抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和CCAAT/增強子結合蛋白α（C/EBPα）等脂肪細胞關鍵的轉錄因子，使細胞保持未分化狀態，從而抑制脂肪的形成[18]。本研究顯示miRNA-133b在單純性肥胖兒童體循環中的表達下調，表達量與體質量、腰圍、腰圍/身高、BMI、胰島素、HOMA-IR等指標呈負相關，與ISI呈正相關。因此，我們初步認為miRNA-142-5p和miRNA-133b可能通過轉錄后水平啟動基因沉默機制參與肥胖相關的脂肪細胞異常分化、IR和脂質代謝紊亂的形成，參與肥胖代謝綜合征的病理生理過程，是一種潛在的肥胖相關代謝異常的分子標志物。

二、miRNA-142-3p、miRNA-486-3p與肥胖

miRNA-142-3p靶基因包括OSBPL3和MAP4K3，其中OSBPL3為細胞內脂質受體氧類固醇結合蛋白（OSBP）家族的成員，參與脂質轉運及膽固醇的結合等生物學過程。MAP4K3為絲裂原活化蛋白激酶家族成員，參與胰島素信號通路的調節。人蛋白激酶B2是miRNA-486-3p的靶基因之一，是磷酸肌醇依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的異構體，主要富集于胰島素敏感組織中，參與胰島素信號通路的調節，對葡萄糖刺激性胰島素反應及脂肪酸的β氧化具有正性調控作用[19]。既往研究表明miRNA-142-3p與miRNA-486-3p在肥胖者或糖尿病患者體循環中的表達水平升高，且與肥胖者的脂肪量、BMI、腰圍、HOMA-IR等指標存在明確相關性[14-15， 20]。本研究顯示，與正常兒童相比，單純性肥胖兒童體循環miRNA-142-3p及miRNA-486-3p表達水平無明顯差異，并與代謝異常、體格測量數據及生化指標無關，這可能與本次研究的樣本量少有關，其在單純性肥胖兒童循環中的表達特點尚需要更大樣本量的研究闡述。

綜上所述，在單純性肥胖兒童體循環中miRNA-142-5p呈高表達，而miRNA-133b卻呈低表達，說明兩者可能參與了兒童肥胖代謝綜合征發生發展的病理生理過程，然而其具體作用機制尚未明確。本研究顯示兩者表達水平與單純性肥胖兒童的體格測量數據、生化指標及代謝異常明顯相關，為探討miRNA-142-5p、miRNA-133b作為肥胖及其相關并發癥生物學標志物的可能性奠定了基礎。

參 考 文 獻

[1] Bartel DP. MicroRNAs： genomics， biogenesis， mechanism， and function. Cell，2004，116（2）：261-297.

[2] Veerle Rottiers，Anders M，Naar. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13（4）：239-250.

[3] 孫冰，朱逞. 小兒肥胖癥與代謝綜合征的關系. 中國實用兒科雜志，2004，19（3）：168-171.

[4] Bartel DP. MicroRNAs： target recognition and regulatory functions. Cell，2009，136（2）： 215-233.

[5] Voinnet O. Origin， biogenesis， and activity of plant microRNAs. Cell，2009，136（4）： 669-687.

[6] Fabian MR， Mathonnet G， Sundermeier T， Mathys H， Zipprich JT， Svitkin YV， Rivas F， Jinek M， Wohlschlegel J， Doudna JA， Chen CY， Shyu AB， Yates JR 3rd， Hannon GJ， Filipowicz W， Duchaine TF， Sonenberg N. Mammalian miRNA RISC recruits CAF1 and PABP to affect PABP-dependent Deadenlation. Mol Cell，2009， 35（6）： 868-880.

[7] Betel D， Wilson M， Gabow A， Marks DS， Sander C. The microRNA. org resource： targets and expression. Nucleic Acids Res，2009，36： D149-D153.

[8] Hon LS， Zhang Z. The roles of binding site arrangement and combinatorial targeting in microRNA repression of gene expression. Genome Biol，2007， 8（9）： R166.

[9] Rottiers V， Najafi-Shoushtari SH， Kristo F， Gurumurthy S， Zhong L， Li Y， Cohen DE， Gerszten RE， Bardeesy N， Mostoslavsky R， N??r AM. MicroRNAs in metabolism and metabolic diseases. Cold Spring Harb Symp Quant Biol，2011，76：225-233.

[10] 康春生，尤永平，浦佩玉. miRNA在惡性腫瘤診斷額治療中的進展.中國神經腫瘤雜志，2007，5（2）：138-141.

[11] Vickers KC， Palmisano BT， Shoucri BM， Shamburek RD， Remaley AT. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nature Cell Biol，2011， 13（4）： 423-433.

[12] Zampetaki A， Kiechl S， Drozdov I， Willeit P， Mayr U， Prokopi M， Mayr A， Weger S， Oberhollenzer F， Bonora E， Shah A， Willeit J， Mayr M. Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes. Circ Res，2010，107（6）：810-817.

[13] Li S， Zhu J， Zhang W， Chen Y， Zhang K， Popescu LM， Ma X， Lau WB， Rong R， Yu X， Wang B， Li Y， Xiao C， Zhang M， Wang S， Yu L， Chen AF， Yang X， Cai J. Signature microRNA expression profile of essential hypertension and its novel link to human cytomegalovirus infection. Circulation，2011， 124（2）：175-184.

[14] Ortega FJ， Mercader JM， Catalán V， Moreno-Navarrete JM， Pueyo N， Sabater M， Gómez-Ambrosi J， Anglada R， Fernández-Formoso JA， Ricart W， Frühbeck G， Fernández-Real JM. Targeting the circulating microRNA signature of obesity. Clin Chem， 2013，59（5）：781-792.

[15] Prats-Puig A， Ortega FJ， Mercader JM， Moreno-Navarrete JM， Moreno M， Bonet N， Ricart W， López-Bermejo A， Fernández-Real JM. Changes in circulating microRNAs are associated with childhood obesity. J Clin Endocrinol Metab，2013，98（10）：E1655-E1660.

[16] Li Y， Yang J， Li S， Zhang J， Zheng J， Hou W， Zhao H， Guo Y， Liu X， Dou K， Situ Z， Yao L. N-myc downstream-regulated gene 2， a novel estrogen-targeted gene， is involved in the regulation of Na+/K（+）-ATPase. J Biol Chem，2011，286（37）： 32289-32299.

[17] Li Y， Tharappel JC， Cooper S， Glenn M， Glauert HP， Spear BT. Expression of the hydrogen peroxide-generating enzyme fatty acyl CoA oxidase activates NF-kappa-B. DNA Cell Biol，2000，19（2）： 113-120.

[18] 羅肖，李惠俠，楊公社.Wnt信號通路與前體脂肪細胞.中國生物化學與分子生物學報，2007，23（10）：791-796.

[19] Li X， Monks B， Ge Q， Birnbaum MJ. Akt/PKB regulates hepatic metabolism by directly inhibiting PGC-1-alpha transcription coactivator. Nature，2007， 447（7147）： 1012-1016.

[20] Collares CV， Evangelista AF， Xavier DJ， Rassi DM， Arns T， Foss-Freitas MC， Foss MC， Puthier D， Sakamoto-Hojo ET， Passos GA， Donadi EA. Identifying common and specific microRNAs expressed in peripheral blood mononuclear cell of type 1， type 2， and gestational diabetes mellitus patients. BMC Research Notes， 2013， 6：491.

（收稿日期：2019-05-28）

（本文編輯：洪悅民）