EPC、FMD與膿毒癥患者病情嚴重程度的相關性研究

陳偉棟 徐嘉 黃振華 古釬林 廖瑾莉 韋秋霞 詹紅

【摘要】目的探討膿毒癥患者外周血循環內皮祖細胞（EPC）數量及肱動脈內皮依賴性舒張功能（FMD）與病情嚴重程度的相關性。方法納入膿毒癥患者15例為膿毒癥組，同期住院非膿毒癥患者巧例為非膿毒癥組，以Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，體外誘導分化EPC，利用ac-LDL及Lectin抗體熒光標記法進行雙陽性計數;用彩色多普勒超聲檢查測定2組患者的FMD;以序貫器官功能衰竭估計（SOFA）評分評價患者病情嚴重程度。結果膿毒癥組患者EPC數量較非膿毒癥組少（33.9±7.7 vs.45.0±7.4，P<0.05），FMD測定值較低[（6.3±1.2）%VS.（7.7±0.9）%，P<0.05]。EPC數量與FMD測定值呈正相關（r_r=0.770，P<0.001）;膿毒癥組患者EPC數量與SOFA評分呈負相關（r_s=-0.615、P<0.001），FMD測定值與SOFA評分呈負相關（r_s=-0.636、P=0.011）。結論膿毒癥患者外周血循環EPC數量及FMD測定值或可作為評估膿毒癥病情嚴重程度的指標。

【關鍵詞】膿毒癥;內皮祖細胞;肱動脈內皮依賴性舒張功能;序貫器官功能衰竭估計評分

膿毒癥是因感染引起宿主反應失調導致的危及生命的器官功能障礙，是急診科常見的危重癥之一，發病率逐年升高，病死率高，救治困難[1-2]。機體發生膿毒癥時，病原體通過炎癥介質、細胞因子等介導而引發一系列的炎癥反應，導致血管內皮損傷。血管內皮功能損傷，一方面，血管舒張、毛細血管滲漏、內皮腫脹等導致的炎性介質浸潤造成組織、器官微循環障礙，引發缺血、缺氧;另一方面，內皮細胞直接參與免疫應答，引起機體免疫功能下降，組織、器官對抗病原體能力下降，造成器官損傷進一步加重[3-4]。內皮祖細胞（EPC）是近年來被發現的一類具有干細胞潛能的前體細胞，能夠定向分化增殖形成成熟的血管內皮細胞，從而起到修復、再生血管作用。在心血管疾病、腦血管疾病、周圍血管疾病及腫瘤血管新生研究中，均證實了EPC在維持和修復內皮細胞功能、血管新生中扮演重要角色[5]。肱動脈血流介導的內皮依賴性舒張功能（FMD）能反映內皮功能紊亂程度，FMD檢測是一種無創、可重復的檢測血管內皮功能的新技術[6]。在膿毒癥發病機制中EPC數量和FMD變化及其作用機制迄今尚未明確。筆者通過測定膿毒癥患者循環EPC數量和FMD，就其與膿毒癥病情嚴重程度的相關性進行初步探討。

對象與方法

一、研究對象

連續納入2017年10月至2018年3月中山大學附屬第一醫院急診科收治的膿毒癥患者15例為膿毒癥組，診斷標準參照2016年拯救膿毒癥運動制定的膿毒癥和膿毒癥休克診斷指南（Sepsis 3.0）[1]。15例中男5例、女10例;同時抽取同期住院的非膿毒癥患者15例作為非膿毒癥組，其中男6例、女9例。所有患者均排除以下情況：①既往有高血壓病、糖尿病、高脂血癥、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦卒中、腫瘤病史;②孕婦;③年齡小于18歲。2組患者基線資料見表1。本研究由中山大學附屬第一醫院倫理委員會批準，人組前所有患者或其家屬均簽署了知情同意書。

二、主要儀器與試劑

紅細胞裂解液、淋巴細胞分離液購于中國碧云天公司，EBM-2培養基、DMEM高糖培養基、胎牛血清和0.25%胰酶購于美國Gibco公司，人纖維黏連蛋白購于康寧公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）、乙酞化低密度蛋白（ac-LDL）一抗和外源凝集素（Lectin）一抗購于美國Sigma公司，4%多聚甲醛購于雷根公司，日立彩色多普勒超聲診斷儀（型號TJ454）。

三、分離外周血單個核細胞及培養EPC

抽取2組患者外周靜脈血15ml，常溫下保存于肝素抗凝管。3h內加入等體積PBS稀釋，抽取混合稀釋后的血液緩慢垂直加入等體積淋巴細胞分離液液面，常溫離心，400g×30min、小心吸取中間的白膜層置于15ml離心管，經PBS 5ml洗滌2次，加入紅細胞裂解液后充分裂解，常溫離心，400g×10min。棄上清后加入EBM-2培養基，混合后均勻鋪于人纖維蛋白包被的6孔細胞培養板，于5%二氧化碳、37℃培養箱常規培養。培養第4日換液，第7日置于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態[7]。

四、細胞計數

細胞培養7d后取一部分貼壁細胞在10μg/L的ac-LDL溶液中孵育1h，之后用4%多聚甲醛固定，以10μg/L的Lectin抗體溶液孵育1h，并置于熒光顯微鏡下觀察拍片，貼壁細胞吞噬ac-LDL熒光染色陽性為紅色，Lectin抗體熒光染色陽性為綠色，雙染色陽性即紅色和綠色雙染色細胞為EPC，計算EPC數量[7]。

五、計算膿毒癥組與非膿毒癥組患者序貫器官功能衰竭估計（SOFA）評分

記錄2組患者循環血壓、氧合指數、肌酐、膽紅素、血小板計數及GCS評分，根據膿毒癥和膿毒癥休克診斷指南（Sepsis 3.0）進行SOFA評分川。

六、受試者朧動脈FMD測定值

使用日立彩色多普勒超聲診斷儀分別測定2組安靜狀態下、反應性充血時肱動脈內徑變化。于右臂肘上2～3cm處探測肱動脈，取其縱切面，調節增益直至前后壁內膜顯示最清晰，同步在心電波形R波頂點處測量心室舒張末期時前后內膜間距作為血管基礎內徑。后行反應性充血試驗，將血壓計袖帶縛于前臂肘關節下2～3cm處，充氣加壓至250mm Hg（1mm Hg=0.133kPa），持續5min后迅速放氣，于放氣后1min內測量朧動脈內徑。在測量過程中，超聲探頭始終固定于同一位置，測量同一處血管[8]。取3個心動周期的平均值，計算充血實驗前后差值與基礎內徑比值。

七、統計學處理

采用SPSS 15.0分析數據。正態分布計量資料以x1s表示，2組間比較采用t檢驗;非正態分布計量資料用中位數（上、下四分位數）表示，組間比較用秩和檢驗。計數資料用率（百分比）表示，組間比較用Fisher確切概率法。相關性采用Spearman秩相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、膿毒癥組與非膿毒癥組EPC數量和FMD測定值的比較

免疫熒光染色圖例見圖1A～C。比較膿毒癥組與非膿毒癥組EPC數量和FMD測定值，結果顯示膿毒癥組EPC數量為33.9±7.7，較非膿毒癥組45.0±7.4少（t=-3.63，P<0.05），見圖1D;膿毒癥組FMD測定值為（6.3±1.2）%，較非膿毒癥組的（7.7±0.9）%低（t=-4.05，P<0.05），見圖1E。

二、膿毒癥組和非膿毒癥組EPC、FMD與SOFA評分的相關分析結果

Spearman秩相關分析結果顯示EPC數量與FMD測定值呈正相關（r_s=0.770，P<0.001）。在膿毒癥組中進一步分析，結果顯示EPC數量與反映患者病情嚴重程度的SOFA評分呈負相關（r_s=-0.615，P=0.015）、且FMD測定值與SOFA評分呈負相關（r_s=-0.636，P=0.011）。

討論

機體發生膿毒癥時，病原體引起的各種炎癥介質及細菌毒素釋放均可造成血管內皮損傷，發生組織滲漏、有效循環血量減少、組織缺血缺氧加重，嚴重者最后發展至MODS。既往的研究表明，內皮細胞損傷的嚴重程度與膿毒癥患者的預后直接相關，內皮功能損傷越嚴重的膿毒癥患者預后越差，病死率越高。血管內皮損傷時，作為內皮細胞前體細胞的EPC從骨髓到損傷部位進行修復及新生血管再生，在維持血管內皮細胞功能上發揮著重要作用。我們通過測定EPC的數量及肱動脈FMD來反映血管內皮功能，從而進一步評估膿毒癥患者的病情嚴重程度。

本研究結果顯示膿毒癥組患者的EPC數量較非膿毒癥組少，這與既往文獻報道的結論相一致。Mayr等[9]發現，將小劑量的內毒素注人人體可減少EPC數量。Zahran等[10]發現，在兒科膿毒癥患兒中，嚴重膿毒癥患兒EPC數量更低，EPC數量高的膿毒癥患兒生存率越高。Fan等[11]發現， EPC及基質細胞生長因子可改善膿毒癥患者預后。徐喜媛等[12]的動物實驗表明，移植到膿毒癥小鼠體內的EPC可成功通過血管進人肺、肝、腎等組織，下調促炎反應程度，提高小鼠的生存率，預示EPC移植或可改善膿毒癥患者預后。我們使用經典的SOFA評分對膿毒癥患者進行器官損傷的評分，發現EPC數量與SOFA評分呈負相關，提示EPC數量可以反映膿毒癥患者的病情嚴重程度。嚴重膿毒癥時EPC數量明顯下降可能與骨髓抑制、EPC損傷破壞、炎癥介質誘導EPC凋亡有關，具體機制尚未明確[13]。

FMD檢測是一種無創的檢查方法，FMD測定值已被廣泛認可作為血管內皮功能的評價指標。本研究中2組患者外周血循環EPC數量與FMD測定值呈正相關，提示EPC數量可以正向反映患者的血管內皮功能，膿毒癥時EPC數量下降伴隨FMD測定值減低，血管內皮功能受損。

我們進行FMD測定值與SOFA評分的相關性分析，發現兩者呈負相關，即SOFA評分越高，FMD測定值越低，表明FMD測定值可以用于評價膿毒癥患者的病情嚴重程度。

總之，膿毒癥患者外周血循環EPC數量減少，FMD測定值降低，且與SOFA評分呈負相關，因此可通過無創的方法測定肱動脈FMD及循環EPC數量來評估器官損傷程度，預測病情預后，為臨床評估膿毒癥病情提供新的檢測手段。EPC或可作為評估膿毒癥嚴重程度新的分子生物學標志物和重要治療靶點，相關機制需作進一步探討。

參考文獻

[1]Singer M，Deutschman CS，Seymour CW，Shankar-Hari M，Annane D，Bauer M，Bellomo R，Bernard GR，Chiche J，Coopersmith CM，Hotchkiss RS，Levy MM，Marshall JC，Martin GS，Opal SM，Rubenfeld GD，van der Poll T，VincentJ，Angus DC.The third international consensus definitions forsepsis and septic shock（Sepsis-3）.JAMA，2016，315（8）：801-810.

[2]Martin GS.Sepsis，severe sepsis and septic shock：changesin incidence，pathogens and outcomes.Expert Rev Anti InfectTher，2012，10（6）：701-706.

[3]章志丹，馬曉春.膿毒癥血管內皮細胞損傷與微循環功能障礙.中華危重病急救醫學，2011，23（2）：125-128.

[4]Bracco D.Microcirculation：more questions than answers.CritCare Med，2009，37（8）：2470-2471.

[5]Ikutomi M，Sahara M，Nakajima T，Minami Y，Morita T，Hirata Y，Komuro I，Nakamura F，Sata M.Diverse contributionof bone marrow-derived late-outgrowth endothelial progenitorcells to vascular repair under pulmonary arterial hypertensionand arterial neointimal formation.J Mol Cell Cardiol，2015，86：121-135.

[6]Liu X，Zhang GX，Zhang XY，Xia WH，Yang Z，So C，QiuYX，Xu SY，Zhan H，Tao J.Lacidipine improves endothelialrepair capacity of endothelial progenitor cells from patients withessential hypertension.Int J Cardiol，2013，168（4）：3317-3326

[7]Yang Z，Chen L，So C，Xia WH，Wang Y，Wang JM，ChenF，Zhang YY，Wu F，Xu SY，Zhang XL，Tao J.Impairedendothelial progenitor cell activity is associated with reducedarterial elasticity in patients with essential hypertension.ClinExp Hypertens，2010，32（7）：444-452.

[8]Lambiase MJ，Dorn J，Thurston RC，Roemmich JN.Flow-mediated dilation and exercise blood pressure in healthyadolescents.J Sci Med Sport，2014，17（4）：425-429.

[9]Mayr FB，Spiel AO，Leitner JAI，Firbas C，Sieghart W，Jilma B.Effects of low dose endotoxemia on endothelial progenitor cells inhumans.Atherosclerosis，2007，195（1）：e202-e206.

[10]Zahran AM，Elsayh KI，Mohamad IL，Hassan GM，Abdou MA.Circulating endothelial cells and endothelial progenitor cells inpediatric sepsis.Pediatr Emerg Care，2016，32（3）：163-167.

[11]Fan H，Goodwin AJ，Chang E，Zingarelli B，Borg K，GuanS，Halushka PV，Cook JA.Endothelial progenitor cells and astromal cell-derived factor-lalpha analogue synergistically im-prove survival in sepsis.Am J Respir Crit Care Med，2014，189（12）：1509-1519.

[12]徐喜媛，楊敬平，那[格日勒，烏日娜，田紅軍，宋慧芳，王慧.內皮祖細胞移植對膿毒癥大鼠的治療作用.中華危重病急救醫學，2015，27（6）：514-519.

[13]張穎軒.內皮祖細胞內皮修復的影響因素.新醫學，2013、44（12）：803-806.

（收稿日期：2018-12-20）

（本文編輯：洪悅民）

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2019.05.010

基金項目：國家自然科學基金青年項目（81801948）;廣東省自然科學基金（2016A030313249）;廣州市科技項目（201804010007）

作者單位：510080 廣州，中山大學附屬第一醫院急診科

通信作者，詹紅，E-mail：zhanhong81@126.com