CCR5第2胞外環特異性拮抗短肽對哮喘小鼠肺組織自噬相關基因的表達和自噬泡形成的影響

劉娟 梁蓉蓉 張穎麗 謝艾岑 黃花榮

【摘要】目的研究CC趨化因子受體5 （CCR5）第2胞外環特異性拮抗短肽對哮喘小鼠肺組織自噬相關基因Beclinl、ATG5、LC3的表達和自噬泡形成的影響。方法將40只BALB/c小鼠隨機分為5組，每組各8只，空白對照組小鼠予生理鹽水腹腔注射致敏、生理鹽水滴鼻激發，致敏組小鼠予雞卵白蛋白（OVA）致敏、生理鹽水激發，哮喘模型組小鼠予OVA致敏、OVA激發，地塞米松磷酸鈉（Dex）組小鼠予OVA致敏、激發后予Dex尾靜脈注射，拮抗短肽組予OVA致敏、激發后予拮抗短肽尾靜脈注射。分別采用實時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡法和透射電鏡評估哮喘小鼠肺組織中自噬水平的變化。結果哮喘模型組的Beclinl、ATG5和LC3 mRNA表達水平及LC3蛋白表達水平均低于空白對照組（P均<0.05），拮抗短肽組的Beclinl、ATG5、LC3mRNA和蛋白表達水平均高于哮喘模型組（P均<0.05）。透射電鏡顯示，哮喘模型組小鼠肺組織中自噬泡數量較空白對照組稍減少，自噬泡主要位于具有免疫功能的2型肺泡上皮細胞。拮抗短肽組、Dex組中自噬泡數量較模型組增多，但多為未成熟的自噬泡，且自噬泡同樣主要位于2型肺泡上皮細胞中。結論哮喘小鼠存在自噬功能障礙，CCR5第2胞外環的特異性拮抗短肽能升高哮喘小鼠肺組織中自噬相關蛋白Beclinl、ATG5和LC3的表達水平。

【關鍵詞】哮喘;自噬;CC趨化因子受體5;拮抗短肽

哮喘是一種以氣道高反應性和支氣管周圍多種炎癥細胞浸潤為主要特征的慢性炎癥性疾病[1]。近年研究顯示，自噬作為一種廣泛存在于真核細胞中高度保守的分解代謝途徑，其功能受損可能與支氣管哮喘的發展進程相關[2]。趨化因子及其受體是研究哮喘發病機制和治療的重要靶點，在募集與激活炎癥細胞上發揮至關重要的作用[3]。CC趨化因子受體5（CCR5）為一種跨膜的信號轉導蛋白，課題組先前的研究表明CCR5第2胞外環的特異性拮抗短肽對核因子-κB（NF-κB）有明顯的調控作用[4]。NF-κB對多種基因的表達有直接的調控作用。有關哮喘小鼠肺組織中CCR5第2胞外環的特異性拮抗短肽對細胞自噬基因的影響，筆者尚未見相關報道。為此，本研究擬探討CCR5第2胞外環的特異性拮抗短肽對哮喘小鼠肺組織自噬相關基因Beclin1、ATG5、LC3表達和自噬泡形成的影響，為哮喘的精準治療提供新的方向，現報告如下。

材料與方法

一、材料與儀器

1.實驗動物

BALB/c小鼠40只，雌性，6～8周齡，體質量20～229、由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，飼養于中山大學東校園實驗動物中心的SPF級環境中，本研究方案經中山大學動物實驗倫理委員會批準（IACUC-DD-17-1207）。

2.主要試劑與儀器

CCR5第2胞外環的特異性拮抗短肽序列由中山大學孫逸仙紀念醫院消化內科鐘英強教授惠贈，經上海吉爾生化公司純化合成。地塞米松磷酸鈉購自中山大學孫逸仙紀念醫院。用生理鹽水分別將拮抗短肽和地塞米松磷酸鈉（Dex）注射液稀釋成濃度為2.5、3.0mg/kg備用[4]。雞卵白蛋白（OVA、V級）購自美國Sigmao Trizol試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成。Beclin 1抗體購自美國Santa Cruzeo ATG5和LC3抗體購自美國Sigmao電鏡固定液購自谷歌生物公司。主要儀器包括熒光定量PCR儀（Light Cycler 480，瑞士）和透射電鏡（Tecnai Spirit Biotwin，FEI公司）。

二、方法

1.分組及干預

哮喘小鼠模型的構建參照本課題組前期的建立方法[4]。將40只小鼠隨機分為5組，每組各8只?？瞻讓φ战M小鼠予0.1ml的生理鹽水腹腔注射致敏、50μl的生理鹽水滴鼻激發，致敏組小鼠予0.1ml（含50μg的OVA）相同部位致敏、50μl的生理鹽水滴鼻激發，哮喘模型組小鼠予0.1ml含50μg的OVA）相同部位致敏、50μl（含 100μg的OVA）滴鼻激發，Dex組小鼠予模型組等體積、等濃度、同部位的OVA致敏、激發后連續7d予Dex 0.2ml尾靜脈注射，拮抗短肽組予模型組等體積、等濃度、同部位的OVA致敏、激發后連續7d予拮抗短肽注射液0.2ml尾靜脈注射給藥。

2.標本采集

于實驗第22日將各組小鼠行斷頸處死，予生理鹽水經右心室灌注后，待雙肺發白后分離肺組織，右肺用于蘇木素一伊紅（HE）染色，左肺收集后置-80℃凍存備用。

3.哮喘小鼠肺組織中自噬泡的透射電鏡觀察

處死小鼠后，即取約米粒大小的肺組織投入電鏡固定液中，置于4℃C冰箱2h。用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗4次，每次15min、后再用1%餓酸4℃固定2h。經過PBS漂洗和乙醇、丙酮脫水后，進行過夜包埋，制成厚度約50～80nm的切片，用醋酸雙氧鈾、拘櫞酸鉛雙染后置于透射電鏡下觀察。

4.Beclinl、ATG5、LC3 mRNA表達水平的檢測

采用實時熒光定量PCR檢測。先利用Trizol法提取肺組織中的總RNA，根據Takara的逆轉錄法將RNA逆轉錄為模板DNA，并進一步參照其反應條件，采用二步法擴增：95℃30s預變性，95℃ 5s持續40個循環，60℃32s退火和延伸。以價actin為內參。引物序列分別為：Beclinl上游5'-GGGTCACCATCCAGGAAC-3、下游5'-CACCATCCTGGCGAG-3'，ATG5上游5=GCGGTTGAGGCTCAC-3、下游5，- GGATATTCCATGAGT-3，LO上游5，- GC GCTTGCAGCT-3、下游5'=GTACACTTCGGAGA-3，β-actin上游5'=CCACCATGTACCCAGGCATT-3、下游5'-AGGGTGTAAAACGCAGCTCA-3。結果分析采用△△CT法計算各基因的相對表達水平。

5.Beclin1、ATG5、LC3蛋白表達水平的檢測 采用蛋白免疫印跡法檢測。先用PIRA裂解液和蛋白酶抑制劑提取肺組織中的總蛋白，用BCA法測相應的蛋白濃度，95℃加熱10min使蛋白變性。利用12%分離膠進行十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺（SDS-PAGE）電泳，然后恒定110V轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%的脫脂奶粉室溫下封閉1.5h后，分別敷上一抗Beclinl、ATG5、LC3、GAPDH（抗體稀釋比例均為1：1000），4℃過夜。將條帶用TBST緩沖液洗4次，每次7min，室溫下孵育相應的二抗（1：5000）持續1h、繼續用TBST緩沖液洗脫4次，每次7min、用高靈敏度化學發光檢測試劑盒進行化學發光反應，顯影、定影，用Image J行灰度值分析、Prism 6.0行圖像分析。

三、統計學處理

采用SPSS 22.0進行數據分析。符合正態分布的計量資料以x±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、成功構建由OVA誘導的小鼠哮喘模型

相對于空白對照組和致敏組而言，哮喘模型組中的支氣管及伴行的血管周圍有大量炎癥細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞和淋巴細胞為主，且支氣管的管壁增厚、上皮細胞損傷，表明該小鼠哮喘模型建立成功，見圖1。

二、5組小鼠的肺組織自噬相關基因相對表達水平比較

5組小鼠的肺組織Bechnl、ATG5和LC3 mRNA相對表達水平比較差異均有統計學意義（F分別為38.347、19.315、15.143，P均< 0.001）o其中哮喘模型組的Beclinl、ATG5和LC3 mRNA相對表達水平低于空白對照組（P均<0.05），分別約為空白對照組的19%、17%、28%0在利用拮抗短肽和Dex注射液干預之后，Beclinl、ATGS和LC3的mRNA相對表達水平較模型組均有所升高，其中拮抗短肽組的Beclinl、ATG5和LO mRNA相對表達水平分別約為哮喘模型組的2.53、3.41、1.96倍，組間比較差異均有統計學意義（P均<0.05），但Dex組的Beclinl、ATG5和LC3 mRNA相對表達水平與哮喘模型組比較差異均無統計學意義（P均>0.05），見圖2。

三、5組小鼠的肺組織自噬相關蛋白表達水平比較

5組小鼠的肺組織Beclinl、ATG5和LO蛋白表達水平比較差異均有統計學意義（F分別為6.260、8.800、11.921，P均<0.001）。哮喘模型組LO的蛋白表達水平低于空白對照組（P<0.05），其Beclinl、ATG5的蛋白表達水平分別約為空白對照組的67%、80%;LO作為自噬形成的標志性蛋白，哮喘模型組蛋白表達水平約為空白對照組的60%。相對于哮喘模型組，自噬相關蛋白Beclinl 、ATG5和LC3的蛋白表達水平在拮抗短肽組均升高，分別為哮喘模型組的1.53、1.42、1.71倍，2組比較差異均有統計學意義（P均<0.05），見圖3。

四、5組小鼠的肺組織自噬泡比較

透射電鏡顯示，哮喘小鼠肺組織中自噬泡數量較空白對照組稍減少，自噬泡主要位于具有免疫功能的2型肺泡上皮細胞。拮抗短肽組、Dex組中自噬泡數量較模型組增多，但多為未成熟的自噬泡，且自噬泡同樣主要位于2型肺泡上皮細胞中，見圖4。

討論

哮喘是一種復雜的、多基因作用的氣道慢性炎癥性疾病，目前的治療仍以糖皮質激素和β2受體激動劑為主，但隨著全球難治性哮喘的發生率逐年升高，尋求新的治療靶點成為研究的熱點之一。

近年國內外的研究以自噬為突破點，尋求其在哮喘中的治療作用。Puleston等[5]認為，自噬功能缺陷的T、B細胞表現出分化和調節受損。敲除小鼠胸腺中的ATG5基因不僅會減少T細胞在外周血中的數量，還會減弱其受到抗原刺激后的增殖作用，出現嚴重的免疫耐受障礙[6]。此外，抑制自噬功能將引起活性氧簇的聚集和損傷性線粒體DNA的釋放增多[7]。Gu等[8]利用辛伐他汀作用于哮喘小鼠，結果顯示哮喘小鼠肺組織中自噬水平低于健康小鼠。上述研究均提示自噬功能低下可能導致支氣管哮喘等疾病的發生。本研究也顯示，哮喘模型組小鼠的肺組織中自噬相關基因Beclinl、ATG5和LC3 mRNA與蛋白表達水平和自噬泡的數量均低于空白對照組，且自噬泡主要位于同樣具有免疫功能的2型肺泡上皮細胞中，進一步闡明在哮喘小鼠的肺組織中，自噬功能存在障礙。

CCR5作為一種調控T細胞和炎癥細胞遷移、增殖和活化的趨化因子受體，不僅在炎癥性腸病、銀屑病、中樞神經系統疾病等發揮作用，還可能促進哮喘的發生與發展[9-10]。本課題組前期已經證實，利用CCR5第2胞外環的特異性拮抗短肽干預哮喘模型小鼠，能有效減輕小鼠肺組織的氣道炎癥反應[4]。Venuti等叫利用CCR5的抗體與其胞外環1結合，結果顯示其可以引起T細胞表面CCR5的陰性表達，可能是因為激活了細胞內的信號通路，形成以CCR5為中心的復合體。上述研究說明，CCR5一方面能直接參與炎癥細胞的調控，另一方面可能通過激活下游信號分子或蛋白間接對炎癥反應進行調節。自噬作為一種在應激狀態下能夠調節細胞分解代謝的途徑，運用CCR5第2胞外環的特異性拮抗短肽能否對其功能造成影響，并調控自噬相關基因的表達，筆者尚未見相關報道。本研究利用Dex干預，并在減輕支氣管周圍炎癥反應的基礎上，采用CCR5第2胞外環的特異性拮抗短肽作用于哮喘小鼠，首次探討該拮抗短肽對自噬相關基因Beclinl、ATG5、LC3表達和自噬泡形成的影響，結果顯示，拮抗短肽組的自噬相關基因Beclinl、ATG5和LC3的mRNA表達水平均高于哮喘模型組，透射電鏡觀察同樣顯示該2組肺組織中的自噬泡數量多于哮喘模型組，提示該拮抗短肽能調控自噬相關基因的表達。

宋楊達等[12]對炎癥性腸病的研究顯示，CCR5第2胞外環的特異性拮抗短肽可抑制TNF/NF-κB信號通路，減輕大鼠結腸炎的組織損傷。本課題組前期研究也顯示，哮喘小鼠中的拮抗短肽能同樣抑制TNF-α的表達。國外對Beclin 1的研究表明，Beclinl可能通過激活NF-κB通路對炎癥因子進行調控[13]。另有研究顯示，TNF-α作為上游因子，在激活下游的NF-κB通路時，可能通過抑制TSC1-TSC2的活性激活mTOR通路，實現對細胞的自噬功能進行調節[14]。上述研究提示，CCR5第2膜外環的特異性拮抗短肽可能是通過TNF/NF-κB信號通路對支氣管哮喘中細胞自噬功能進行調控的。

綜上所述，本研究首次探討CCR5第2胞外環的特異性拮抗短肽對哮喘小鼠自噬相關基因表達與自噬泡形成的影響，證實在哮喘小鼠中存在自噬功能障礙，而拮抗短肽能提高其自噬水平，且這一機制可能與TNF/NF-κB信號通路有關，這為哮喘的精準治療研究提供了新方向。

參考文獻

[1]Berair R，Brightling CE.Asthma therapy and its effect on airwayremodelling.Drugs，2014，74（12）：1345-1369.

[2]Zeki AA，Yeganeh B，Kenyon NJ，Post M，Ghavami S.Autophagy in airwa，diseases：a new frontier in human asthma？Allergy，2016，71（1）：5-14.

[3]Scurci I，Martins E，Hartley O.CCR5：established paradigmsand new frontiers for a‘celebritychemokine receptor.Cytok-ine，2018，109：81-93.

[4]梁蓉蓉，李雯靜，劉娟，沈溪明，黃花榮.CCR5第二胞外環的拮抗短肽對哮喘小鼠炎癥細胞浸潤和TNF-。表達的影響.中國病理生理雜志，2017，33（4）：596-602.

[5]Puleston DJ，Simon AK.Autophagy in the immune system.Imm-unology，2014，141（1）：1-8.

[6]Parzych KR，Klionsky DJ.An overview of autophagy：morpho-logy，mechanism，and regulation.Antioxid Redox Signal，2014，20（3）：460-473.

[7]Farooq MB，Walsh GM.Autophagy and asthma.Clin ExpAllergy，2016，46（1）：7-9.

[8]Go W，Cui R，Ding T，Li X，Peng J，Xu W，Han F，Goo X.Simvastatin alleviates airway inflammation and remodellingthrough up-regulation of autophagy in mouse models of asthma.Respirology，2017，22（3）：533-541.

[9]Jiao X，Velasco-Velazquez MA，Wang M，Li Z，Rui H，PeckAR，Korkola JE，Chen X，XU S，DuHadaway JB，Guerrero-Rodriguez S，Addya S，Sicoli D，Mu Z，Zhang G，Zhang X，Cristofanilli M，Fatatis A，Gray JW，Zhong JF，PrendergastGC，Pestell RG.CCR5 governs DNA damage repair and breastcancer stem cell expansion.Cancer Res，2018，78（7）：1657-1671.

[10]Ye X，Liu S，HU M，Song Y，Huang H，Zhong Y.CCR5expression in inflammatory bowel disease and its correlationwith inflammatory cells and β-arresting expression.Scand JGastroenterol，2017，52（5）：551-557.

[11]Venuti A，Pastori C，Pennisi R，Riva A，Sciortino MT，LopalcoL.Class B β-arresting-dependent CCR5 signalosome retentionwith natural antibodies to CCR5.Sci Rep，2016，6：39382.

[12]宋楊達，劉思雪，宋銥航，沈溪明，黃花榮，鐘英強.CCR5第一和第二胞外環特異性拮抗短肽對大鼠結腸炎的炎癥細胞浸潤及NF-KB/TNF-α信號通路的影響.新醫學，2018，49（5）：309-314.

[13]Cadwell K.Crosstalk between autophagy and inflammatorysignalling pathways：balancing defence and homeostasis.NatRev Immunol，2016，16（11）：661-675.

[14]Pan H，Zhang Y，Luo Z，Li P，Liu L，Wang C，Wang H，Li H，Ma Y.Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotypedparticle-induced lung inflammation through NF-κB and p38MAPK signaling pathways.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2014，306（2）：L183-L195.

（收稿日期：2018-12-26）

（本文編輯：林燕薇）

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2019.05.008

基金項目：廣東省自然科學基金（2015A030313027，2016A03031343）;廣州市科技計劃項目（20180301004）

作者單位 510120 廣州，中山大學孫逸仙紀念醫院兒科廣東省惡性腫瘤表觀遺傳和基因調控重點實驗室

通信作者，黃花榮，E-mail：hhrvivi@126.com