填精通絡方及其拆方對糖尿病性勃起功能障礙大鼠的性激素及陰莖海綿體eNOS酶表達的影響＊

商建偉，盛 文，李憲銳，穆 俊，于旭東，柳紅芳

（1.北京中醫藥大學東直門醫院 北京 100700；2.湖南中醫藥大學基礎醫學院 長沙 410208；3.首都醫科大學附屬北京婦產醫院 北京 100123）

1 研究背景

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED）是最常見的一種男性性功能疾病，指陰莖持續不能達到和（或）維持足夠的勃起以完成滿意滿意性生活，是目前眾多男性非常關心的問題[1],而糖尿病（diabetes mellitus，DM）人群中并發ED的概率是普通人的2-3倍[2,3]，且臨床癥狀更為嚴重[4]，在60周歲以上的中老年DM患者中，ED的發病率甚至可達到95%以上[5]。研究表明，DM是引起勃起功能障礙的最重要器質性疾病之一，DM并發ED的概率是非DM患者的3倍（分別為49.3%和15.6%）[6]。DM病程延長和其他血管神經并發癥的出現而升高[7]、ED發病率隨年齡增長而不斷增加。

DM屬于中醫“消渴病”的范疇；勃起功能障礙屬中醫“陽痿”、“陰痿”范疇。DM并發ED即中醫學的消渴合并陽痿。在消渴病的發展進程中，消渴日久，則必然發展為下消，導致腎精虧虛；腎虛日久，則元氣虧虛、精血耗傷，無力推行氣血，血瘀脈絡是導致消渴并發陽痿的重要基礎。因此，腎精虧虛、血瘀脈絡是糖尿病性勃起功能障礙的根本病機[8]。本實驗采用DMED大鼠模型，觀察填精通絡方及其拆方對生殖激素和陰莖海綿體結構的影響，探討其治療糖尿病性勃起功能障礙可能的作用機制。

2 材料與方法

2.1 實驗動物

SPF級成年雄性SD大鼠60只（8周齡，體質量230±50 g）購自北京維通利華驗動物科技有限公司（合格證號NO.SYXK（京）2012-0001，北京，中國）。大鼠在標準的實驗室條件下飼養，提供標準食物和水。北京中醫藥大學東直門醫院動物與人類倫理委員會批準了這項研究。

2.2 試劑及儀器

鏈脲佐菌素（STZ）、阿撲嗎啡(APO)、檸檬酸鈉和檸檬酸購自美國sigma公司；血糖儀及試紙購自美國強生公司；大鼠睪酮（T）、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）ELISA檢測試劑盒購自中生北控股份有限公司；eNOS、p-eNOS兔抗大鼠一抗(Cell signaling公司，美國)；脫水機（Leica TP1020）—上海徠卡儀器有限公司、包埋機（KD-BM）—浙江省金華市科迪儀器設備有限公司、凍臺（JB-L5）—武漢俊杰電子有限公司、切片機（RM2016）—上海徠卡儀器有限公司、攤片機（KDP）—浙江省金華市科迪儀器設備有限公司、烘箱（DHG-9077A）—上海精宏實驗設備有限公司、光學顯微鏡（XSP-C204）—重慶光電儀器有限公司。

2.3 中藥的制備

所有中藥顆粒都來自北京中醫藥大學東直門醫院（中國北京）。填精通絡方顆粒由以下成分組成：淫羊藿15 g，熟地黃10 g，水蛭10 g，川牛膝10 g；填精方由淫羊藿15 g，熟地黃10 g組成；通絡方由水蛭10 g，川牛膝10 g組成。將顆粒溶于蒸餾水中，并在2-8℃儲存直至進一步使用。

2.4 DMED大鼠分組與模型

將成模大鼠隨機分為正常組、模型組、對照組、填精通絡組、填精組及通絡組，每組10只。模型組、對照組、填精組、通絡組及填精通絡組大鼠建立DMED大鼠模型。將1 g STZ溶解在100 mL檸檬酸鈉-檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 4.5）中以達到最終濃度為10 mg·mL-1，在冰上操作并避光保存。禁食12小時后，以50 mg·kg-1劑量腹腔注射STZ溶液在右下腹。在STZ注射后72小時，1周和2周各從大鼠的尾靜脈抽血測試血糖。每次的隨機血糖＞16.7 mmol·L-1，尿量增加和飲食增加是成功DM大鼠模型的標志。

根據Heaton的方法[9]，將DM大鼠稱重并放置在透明的玻璃箱中，光線暗到僅供觀察，房間保持安靜。在適應環境15分鐘后，每只大鼠在頸部皮膚松弛處注射APO100 μg·kg-1并觀察30分鐘。陰莖增大，包皮回縮，龜頭陰莖充血，陰莖末端出現稱為陰莖勃起。如果勃起次數≥1，則認為勃起試驗陽性。血糖＞16.7 mmol·L-1且勃起試驗陰性的大鼠為DMED造模成功。

2.5 實驗方法

造模成功后，正常組及模型組每日灌胃等體積的蒸餾水，對照組予以0.2 mg·kg-1他達拉非灌胃，每周兩次；填精通絡組予以填精通絡方以9.3(g·kg-1)·d-1灌胃，填精組予以拆方Ⅰ號以7.2(g·kg-1)·d-1灌胃，通絡組予以拆方Ⅱ號以2.1(g·kg-1)·d-1灌胃，正常組與模型組分別灌服等體積蒸餾水，連續30天。

2.6 指標檢測及方法

①大鼠血糖檢測：采用大鼠尾部取血的方式取血，使用便攜式血糖儀檢測各組大鼠治療前后的血糖水平；②大鼠性激素檢測：大鼠以10%的水合氯醛按3 mL·kg-1體重比腹腔注射進行麻醉，麻醉后采腹主動脈血，離心后取上層血清，用酶聯免疫分析法測定各組大鼠的大鼠睪酮（T）、黃體生成素（LH）、促卵泡素（FSH）等性激素水平的差異；③取1 cm陰莖組織石蠟包埋切片，進行eNOS的免疫熒光染色。400倍光鏡下采集圖像，利用圖像分析軟件（Image-ProPlus 6.0）來分析熒光吸光度。

2.7 統計分析

所有來自本研究的計量數據均使用SPSS 20.0統計軟件進行分析。結果表示為平均值±標準偏差。在滿足正態分布條件下，各組間采用獨立樣本t檢驗；不滿足正態分布情況下，若滿足方差齊性，則使用單因素方差分析（ANOVA）分析組間差異，若不滿足方差齊性，則采用非參數檢驗法，P＜0.05表示差異顯著。

3 結果

3.1 大鼠一般情況

隨著病程的進展，模型組、對照組、填精組、通路組以及填精通絡組均出現多飲、多食、多尿、毛失、去光澤、脫毛、活動減少等DM癥狀。而正常組的大鼠毛色光亮順滑，體重增加，好動。

3.2 治療前后大鼠血糖水平差異

實驗結果表明，填精通絡方能明顯降低大鼠血糖水平。填精組、通絡組、填精通絡組治療后血糖均顯著低于治療前血糖（P＜0.01）。與模型組比較，填精組、通絡組及填精通絡組的血糖明顯降低（P＜0.01）；與對照組比較，填精通絡組的血糖明顯降低（P＜0.01）；與通絡組比較，填精組和填精通絡組的血糖明顯降低（P ＜ 0.05）（表1）。

3.3 大鼠性激素水平差異

實驗結果表明，填精通絡方能明顯升高大鼠血清T水平。填精組、通絡組及填精通絡組的血清T要明顯高于模型組（P＜0.05）；填精通絡組的血清T含量明顯高于對照組（P＜0.05）；填精通絡組的血清T含量明顯高于填精組和通絡組（P＜0.01）。LH與FSH在各組外周血液中濃度均無明顯變化（P＞0.05）（表2）。

3.4 大鼠陰莖海綿體eNOS酶表達情況

大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達主要在陰莖海綿體血管內皮細胞及竇狀隙內皮細胞的細胞核和細胞漿內。利用圖象分析系統來測定每組的eNOS酶的含量多少。實驗結果表明：填精通絡方能明顯改善大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達情況。填精組、通絡組及填精通絡組的大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達情況明顯高于模型組（P＜0.01）；填精通絡組的大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達情況明顯高于對照組（P＜0.05）；通絡組的大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達情況明顯高于填精組（P＜0.05）；填精通絡組的大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達情況明顯高于填精組和通絡組（P＜0.01）（表3）。

3.5 陰莖海綿體病理組織學結果

正常組陰莖海綿竇毛細血管豐富，未見明顯的陰莖海綿體間隔，可見大量不規則血竇間隙，血竇、內皮細胞、平滑肌細胞、間質組織及微血管腔結構清晰，血竇間隙表面附有扁平的內皮細胞，血竇小梁含有大量平滑肌細胞及膠原纖維。模型組陰莖海綿體間隔明顯，陰莖海綿體血竇、內皮細胞、平滑肌細胞分布雜亂，陰莖海綿體平滑肌細胞數量減少，血管內皮細胞連續性破壞，膠原纖維密度增加，間質組織大量增生、排列紊亂，血管壁增厚，呈纖維樣變，管腔變小或閉塞。其余各組病理變化介于兩者之間（圖1）。

表1 各組大鼠治療前后血糖比較（mmol·L-1，x±s）

表2 大鼠性激素水平差異

表3 大鼠陰莖海綿體eNOS酶表達情況

4 討論

圖1 陰莖海綿體組織病理學檢測

腎精虧虛、脈絡瘀阻是DMED最基本病機，治療當以補腎活血，填精通絡為首要。辨證施治時需在補腎活血，填精通絡的前提下，再根據不同的證型具體的臨證加減藥物及其用量。“氣為血之帥，血為氣之母。”氣虛則難以推動血行，導致氣虛血瘀，脈絡瘀阻。使得宗筋不得氣血之濡養，則發為陽痿。所謂“腎虛必致血瘀，瘀血必歸于腎”[10]，是因為血瘀脈絡而導致腎精化生不暢。所以，DMED在治療上應以補腎活血，填精通絡為主要的治療方法，腎精得補，淤血得散才能使得腎中精氣化生有源，宗筋得以氣血濡養，方能起痿。

臨床上我們發現填精通絡方在治療DMED上有著良好的效果，不僅能過改善患者勃起功能，還能明顯輔助降低患者血糖。研究表明[11]DMED的嚴重情況和血糖控制情況是密切的，DMED的治療是以控制血糖為基礎的，防止糖尿病對血管、神經的進一步損害。本實驗結果表明，填精組、通絡組、填精通絡組治療后血糖均顯著低于治療前血糖，尤其是填精通絡組最為明顯，但不管何組，血糖降低的幅度并不大，可見在治療DM的時候，還是其他輔助方式來治療DM。

T是一種類固醇類雄激素，主要由睪丸間質細胞分泌。T能通過提高男性性欲[12]、激活一化氮合酶[13]、降低陰莖海綿體血管收縮[14]等方面來刺激陰莖的勃起及維持。臨床上我們也發現DM患者血清T水平偏低，補充一定量的T也有助于改善患者的勃起功能。本實驗結果表明，填精組、通絡組及填精通絡組的血清T要明顯高于模型組，尤其是填精通絡組，雖然仍不及正常組，但是改善效果依然明顯，但各組中LH與FSH在各組外周血液中濃度均無明顯變化，我們分析可能的原因是填精通絡方能通過改善T產生的環境從而升高血清T水平，但填精通絡方對于垂體分泌的FSH與LH卻沒有明顯的影響。

陰莖勃起是在機體神經內分泌的調控下陰莖海綿體血管活動的過程，海綿體內神經末梢及海綿竇內皮細胞在eNOS酶的作用下合成并釋放一氧化氮(nitric oxide,eNOS),進而導致陰莖海綿體血管平滑肌舒張，大量血流進入海綿體組織，從而導致海綿體內壓升高完成勃起過程[15]。本實驗結果表明：填精通絡方能明顯改善大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達情況；填精組、通絡組及填精通絡組的大鼠陰莖海綿體eNOS酶的表達情況明顯高于模型組，尤其是以填精通絡組最為明顯，而對照組陰莖海綿體eNOS酶的表達情況要高于填精組和通絡組，說明他達拉非能明顯改善陰莖海綿體eNOS酶的表達情況，這也是他達拉非治療ED的具體機制之一；而填精通絡組的改善優于對照組，但是仍低于正常組,說明填精通絡組在治療DMED方面,治療方案還有待進一步的改善。