藥用植物箭葉淫羊藿EsMIXTA基因的克隆及其表達(dá)分析＊

李 明，孫 偉

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院藥學(xué)部 北京 100070；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100070）

1 前言

植物的表皮毛（trichomes）是植物葉片和其他器官的表面突起。植物的表皮毛通常被稱為腺毛是植物重要的保護(hù)組織及次生代謝產(chǎn)物分泌的場所。腺毛可以通過分泌特定的物質(zhì)從而對抗侵蝕者、微生物的侵?jǐn)_。從形態(tài)學(xué)上可以把表皮毛劃分為兩類細(xì)胞分別是單細(xì)胞非腺性的，一類是多細(xì)胞的腺性的[1]。有些植物可能只具有一類腺毛類型，但大多數(shù)植物往往兼有兩種腺毛類型。植物各個器官表皮分布著由角質(zhì)層和疏水的蠟質(zhì)層組成的化學(xué)物質(zhì)，它們可以有效的增加植物的表皮機(jī)械力，同時由于不同組織間角質(zhì)層和蠟質(zhì)層的比例不一樣，其各個器官的屬性也就有著較大的區(qū)別。從通過分子生物學(xué)手段對模式植物擬南芥研究后發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的glassy hair 6(glh6)和ATP-binding cassette G family member 11(abcg11)等基因也參與著表皮角質(zhì)層和蠟質(zhì)層的生物合成。從調(diào)控角度上講，擬南芥的表皮毛發(fā)育同根毛發(fā)育具有相同的機(jī)制，大部分由MYB-bHLH-WD40轉(zhuǎn)錄復(fù)合體調(diào)控著表皮毛的形成和分化[2]。同時細(xì)胞內(nèi)的離子通道、細(xì)胞骨架、微管和微絲的分布也在調(diào)控著表皮毛的發(fā)育。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中成員龐大的基因家族之一[3,4]。在這其中R2R3類MYB基因則是整個MYB基因家族成員最多，這類蛋白擁有兩個MYB repeat結(jié)構(gòu)域，因為被命名為R2R3 MYB。R2R3 MYB基因家族成員在越來越多的物種有所報道，比如其中擬南芥中已發(fā)現(xiàn)超過198個MYB家族基因，而在棉花基因組中有200個MYB基因。功能研究表明，MYB類轉(zhuǎn)錄因子參與了植物次生代謝物質(zhì)的調(diào)控、植物激素和環(huán)境因子應(yīng)答，同時在植物器官發(fā)育角度上看MYB基因在植物細(xì)胞的分化、細(xì)胞周期調(diào)控以及葉片等器官形態(tài)建成起到重要的作用。其中的group 9類主要負(fù)責(zé)表皮細(xì)胞的形成和分化。這類基因最早是在金魚草中報道的，它調(diào)控著金魚草花瓣表皮柱狀細(xì)胞的形成[5]。同時在金魚草中也同時存在著MIXTA基因的旁系同源基因即MIXTA-LIKE 1、MIXTA-LIKE 2和MIXTA-LIKE 3，他們都在金魚草花表皮細(xì)胞突起的形成過程中起到了關(guān)鍵性的作用，但是它們的功能并不冗余[6]。除了金魚草外，MIXTA基因控制植物表皮發(fā)育的功能已經(jīng)在大量植物中進(jìn)行了克隆及功能驗證，他們包括楊樹、矮牽牛及樹石斛等[7-9]。在擬南芥中AtMYB106和AtMYB16通過不同的方式調(diào)控著擬南芥表皮毛的發(fā)育，其中AtMYB106和APETALA2/ETHYLENERESPONSE FACTOR(AP2/ERF),WAXES INDUCER1/SHINE1一起調(diào)控著擬南芥的角質(zhì)層形成，從而控制著擬南芥表皮毛的分布。最近通過群體遺傳學(xué)及二代測序技術(shù)相結(jié)合生物信息學(xué)分析方法對猴面花得EMS突變體進(jìn)行BSA（Bulk segregation analysis）群體分析后，也闡明了一個和蜜腺發(fā)育相關(guān)的MIXTA基因[10]。針對藥用植物表皮毛發(fā)育研究直接關(guān)系到藥用成分的合成以及分泌，通過對黃花蒿的表皮毛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的深入研究，一個名為AaMIXTA1的R2，R3-MYB類的轉(zhuǎn)錄因子基因被成功克隆。通過超表達(dá)及RNAi實驗證明，AaMIXTA1基因可以有效控制青蒿素的合成，這是由于其可以控制黃花蒿葉片表皮毛外表皮蠟質(zhì)合成基因的表達(dá)。通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)超表達(dá)AaMIXTA基因的黃花蒿品系并未使黃花蒿的表皮毛形態(tài)發(fā)生異形改變，同時又提高了青蒿素的含量，這為轉(zhuǎn)基因育種提供了更好的研究思路[11]。從基部真雙子葉植物唐松草中克隆得到的MIXTA-like2基因可以使轉(zhuǎn)基因煙草的表皮突起增加,驗證了唐松草中MIXTA-like2基因的功能[12]。

淫羊藿為中國傳統(tǒng)中草藥之一，具有2000多年的悠久歷史。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，淫羊藿有“主陰痿絕傷，莖中痛，利小便，益氣力，強(qiáng)志”的功效。《日華子本草》則稱淫羊藿“能治一切風(fēng)冷勞氣，補(bǔ)腰膝，強(qiáng)心力，丈夫絕陽不起，女子絕陰無子。筋骨攣急。四肢不任，老人昏耄，中年健忘”。它不僅具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效，而且還兼有抗衰老、改善免疫功能、抑制腫瘤和抗骨質(zhì)疏松等功效，其有效成份主要為黃酮醇苷類物質(zhì)。針對淫羊藿所開展的調(diào)控研究已經(jīng)在MYB類型的基因有所報道，比如EsMYBA1基因和EsAN2可以調(diào)控花青素的生成[13]，EsMYBF1可以調(diào)控黃酮醇的形成[14]，EsMYB9基因可以同時調(diào)控花青素和黃酮醇的形成[15]。

淫羊藿的花被從外至內(nèi)分別稱之為外萼片、內(nèi)萼片和花瓣（距）。外萼片通常為紫色或綠色；外一對較小，卵狀長圓形；內(nèi)一對較大，卵形或闊卵形，有時具白色邊。由于該屬外萼片較小，早落，種間差別不大，一般不作為分種的依據(jù)。內(nèi)萼片花瓣狀，水平展開或略反折，呈三角形、卵形、寬卵形或披針形；花瓣的形態(tài)也比較多樣化，呈瓣片狀、具長距、具短距或囊狀等。內(nèi)萼片形態(tài)、花瓣（距）的形態(tài)及與二者的大小關(guān)系是最穩(wěn)定的形態(tài)性狀，在屬下分組和分種中具有重要的意義。本項研究以藥用植物箭葉淫羊藿作為研究對象，參考本草基因組的方法體系[16,17]，通過同源克隆的研究策略成功地對控制表皮毛發(fā)育相關(guān)基因EsMIXTA進(jìn)行克隆及表達(dá)分析，為以后通過基因工程改造箭葉淫羊藿表皮發(fā)育，提高次生代謝產(chǎn)物的合成提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料與實驗試劑

大腸桿菌（Escherich coli）DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞購買于全式金公司。Trizol RNA提取試劑及反轉(zhuǎn)酶Superscript III購自于英偉創(chuàng)津公司（Invitrogen，China）；瓊脂糖凝膠試劑盒購自于天根公司（Tiangen，China）；ExTaq酶、pMD19-T載體及熒光實時定量PCR試劑購自于購自于寶生物公司（Takara，Japan）。

2.2 RNA提取及cDNA第一條鏈合成

取箭葉淫羊藿的根、葉和花，在180-200℃烘烤過的研缽中用液氮將其充分研磨，迅速倒入無RNA酶的離心管中，待液氮揮發(fā)后，按1 mL試劑/100 mg材料的比例加入適量的Trizol反應(yīng)試劑（Invitrogen公司），并按照Trizol試劑盒的說明書進(jìn)行RNA的提取。基因3′端 獲 得 的 cDNA 合 成 以 3′CDS:5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3′為引物，而 5’端獲得的cDNA合成初始則需以引物5′CDS:和SMART II A oligo 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3作為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄過程參考Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶說明書。

2.3 EsMIXTA基因的克隆

根據(jù)已有報道的唐松草中的MIXTA基因且簡并引物作為正向引物[12]，以 UPM1:5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′和 UPM2：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′引物作為反向引物進(jìn)行EsMIXTA基因的3′端克隆。反應(yīng)體系：以2 μL的第一鏈cDNA為模板；2 μL正、反向引物（UPM）（10 μM）；5 μL 10×PCR 緩沖液；2 μL dNTP（2mM）；1 U ExTaq DNA聚合酶；用無菌去離子水將體系補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，10個循環(huán)；每個循環(huán)減一度。94℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，25個循環(huán)；72℃延伸10 min。結(jié)果檢測：取PCR產(chǎn)物5 μL，電泳檢測，切膠回收，連接載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆進(jìn)行測序。在獲得正確的EsMIXTA基因的3′端后，以該序列作為候選序列，設(shè)計基因5′端的反向引物。EsMIXTA基因5′端的獲得；反應(yīng)體系同3′端基因的獲得，正向引物為UPM（10 μM）；反向引物為基因特異性引物。對EsMIXTA基因5′端及3′端進(jìn)行分析后設(shè)計全長引物EsMIXTAFULF:ATGGGTCGATCACCGTGTGAT和EsMIXTAFULR:CAGGAGAACGGGAGGGAGAA。

2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

從-80℃超低溫冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上，加入5 μL連接產(chǎn)物，混勻，冰浴30 min。將含有感受態(tài)細(xì)胞和連接產(chǎn)物的離心管置于42℃恒溫水浴鍋中，熱激60 s，不要搖晃。然后，立即冰浴2 min。加入750 μL LB培養(yǎng)基，混勻，置于37℃搖床上，約150 rpm，培養(yǎng)45-60 min。4000 rpm，離心5 min。在含氨芐青霉素的 LB 平板上涂上 X-Gal（20mg·mL）40 μL，晾干。從離心后的離心管中吸去500 μL上清后，用剩余的上清液將菌體混勻，并加入IPTG（200mg/ml）20μl，涂于LB平板上。將平板于37℃培養(yǎng)12-16h。

2.5 EsMIXTA基因的表達(dá)模式

以箭葉淫羊藿根、葉、萼片、花瓣及雄蕊雌蕊混合材料為研究對象，用Trizol試劑盒提取總RNA，然后用PrimeScript RT reagent Kit(Takara,Japan)進(jìn)行，第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄。在進(jìn)行PCR反應(yīng)前，將第一鏈cDNA稀釋10倍作為模板。然后利用SYBR?Premix Ex TaqTM II(Takara,Japan)反應(yīng)試劑盒，在型號為ABI7500的實時定量PCR儀上以引物EsMIXTRTF:5′-TAACGGAGCAGTCGAAAAGTGA-3′EsMIXTR:5′-CGGTGTCTCCACTACCGTCTG-3′來完成反應(yīng),并根據(jù)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法利用ABI7500軟件（基因有限公司）分析所獲得的數(shù)據(jù)并計算樣品中目的基因濃度。本實驗所用的PCR反應(yīng)體系為20 μL，共設(shè)置3個重復(fù)，反應(yīng)條件為40個循環(huán)，95°5 s、60°34 s。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

序列經(jīng)過EMBL網(wǎng)站MUSCLE在線軟件進(jìn)行比對，之后再通過Modeltest進(jìn)行最大似然法參數(shù)選擇計算，最終運(yùn)用MEGA 5.0中進(jìn)行最大似然樹（Maximum Likelihood）的構(gòu)建，自舉檢驗（bootstrapvalue）為1000次。

2.7 花萼片和花瓣表面的掃描電鏡觀察

收集箭葉淫羊藿花萼片和花瓣立即進(jìn)行固定和處理材料，其中固定液為FAA或者戊二醛。將固定至少24小時以上的材料，經(jīng)不同濃度乙醇梯度脫水后轉(zhuǎn)入95%乙醇中，過夜。脫水：將剝出的材料轉(zhuǎn)入無水乙醇中，脫水20 min。此后，將材料相繼轉(zhuǎn)入75%乙醇+25%乙酸異戊酯；50%乙醇+50%乙酸異戊酯；25%乙醇+75%乙酸異戊酯；100%乙酸異戊酯中，每級20 min。二氧化碳臨界點干燥。將干燥好的原基材料在解剖鏡下用雙面膠粘在金屬臺上。在離子濺射儀上對粘好的金屬臺進(jìn)行噴金、鍍膜。掃描電鏡下觀察照相。

3 結(jié)果與分析

3.1 箭葉淫羊藿EsMIXTA基因的克隆與序列分析

經(jīng)克隆后測序獲得EsMIXTA基因的全長，經(jīng)過ORF search預(yù)測其開放閱讀框長度為1163bp。經(jīng)過對EsMIXTA基因所編碼蛋白進(jìn)行Blastp的比對后發(fā)現(xiàn)，EsMIXTA蛋白和唐松草Thalictrum thalictroide MIXTA基因MYBML2蛋白具有最大的相似度。通過對EsMIXTA蛋白與已有的MIXTA蛋白進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)EsMIXTA蛋白具有典型的R2 R3-MYB蛋白的結(jié)構(gòu)域，即N端含有典型的結(jié)構(gòu)域R2結(jié)構(gòu)域和R3結(jié)構(gòu)域，并擁有subgroup9的專屬結(jié)構(gòu)域（圖1）。在對MIXTA基因通過核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹重建后發(fā)現(xiàn)，EsMIXTA基因與唐松草中的MIXTA基因親緣關(guān)系較近（表1，圖2），由于唐松草屬和淫羊藿屬都隸屬于毛茛目，所以其基因的親緣關(guān)系較近符合進(jìn)化生物學(xué)觀點。

3.2 EsMIXTA基因在不同組織中的表達(dá)分析

實時定量PCR的結(jié)果顯示EsMIXTA基因在箭葉淫羊藿的根、葉及其花器官中均有一定的表達(dá)，其中根中EsMIXTA基因的相對表達(dá)最高，其次是葉片，相比根部和葉片，在花器官中該基因的表達(dá)明顯低（圖3）。

圖1 箭葉淫羊藿MIXTA基因編碼蛋白氨基酸與其他植物同源基因比對

表1 MIXTA類基因系統(tǒng)發(fā)育樹數(shù)據(jù)

通過對箭葉淫羊藿的花瓣狀萼片和花瓣的上下軸面進(jìn)行觀察，我們可以觀察到花萼片的上軸面具有明顯的凸起（圖4a），而花瓣的上軸面凸起并不明顯（圖4b）。從下軸面來看，花萼片的下軸面呈現(xiàn)出不規(guī)則的條紋狀突起（圖4c），而花瓣的下軸面則與上軸面形態(tài)類似即矩形微突起（圖4d）。

圖2 通過ML（最大似然）算法對MIXTA類基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹重建

4 討論

在本項研究中，我們通過反向遺傳學(xué)的手段在中藥箭葉淫羊藿中克隆得到了一個MYB基因，通過蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，它含有保守氨基酸序列R2和R3兩個區(qū)域。同時該基因所編碼的蛋白質(zhì)擁有特殊性的subgroup9類MYB特有的保守氨基酸基序，從而可以認(rèn)定該基因?qū)儆趕ubgroup9類型的R2R3 MYB基因。從植物分子系統(tǒng)學(xué)角度看箭葉淫羊藿中的MIXTA基因和唐松草MIXTA基因聚成一支，它們都是basal core eudicot（基部真雙子葉類型）物種，所以從進(jìn)化角度上講，EsMIXTA基因為TtMIXTA基因的直系同源基因。。

圖3 EsMIXTA基因在不同器官中的表達(dá)模式

圖4 箭葉淫羊藿萼片和花瓣上下軸面微形態(tài)。

從形態(tài)學(xué)角度來觀察，箭葉淫羊藿的萼片上表面表現(xiàn)出不規(guī)則的突起狀態(tài)，這一形態(tài)特征明顯大于花瓣上表面的細(xì)胞形態(tài)。由于箭葉淫羊藿的萼片呈現(xiàn)出大、且花瓣狀的形態(tài)，而花瓣則呈現(xiàn)出囊狀的形態(tài)。這一類淫羊藿明顯不同于像巫山淫羊藿等長距類型，我們認(rèn)為箭葉淫羊藿中的萼片可能起到了招引傳粉者的關(guān)鍵作用，當(dāng)然這個假設(shè)需要得到繁殖生物學(xué)的證據(jù)。從我們的表達(dá)數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)EsMIXTA基因在箭葉淫羊藿的各個器官中都有所表達(dá)，這一結(jié)果和之前報道過的金魚草[6]、矮牽牛[7]和唐松草[12]的結(jié)果類似，這表明EsMIXTA基因很有可能調(diào)控著細(xì)胞突起這一形態(tài)特點，使得箭葉淫羊藿的萼片呈現(xiàn)出花瓣狀的形態(tài)。同時我們發(fā)現(xiàn)EsMIXTA基因在根中的表達(dá)量高，這可能和根毛形成有著密切的聯(lián)系。深入的研究需要通過本物種的轉(zhuǎn)基因試驗或者異源表達(dá)去驗證EsMIXTA基因在箭葉淫羊藿中的功能。