紅花寄生對尿酸鈉誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的干預(yù)作用＊

楊興鑫，彭小驥，胡海波，董金材，顧 雯，梁 麗，梁小燕，熊獻琪，何旭東，俞 捷＊＊

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 昆明 650500；2.昆明市代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室昆明 650500；3.贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 贛州 341000）

痛風(fēng)（Gout）是由于嘌呤代謝紊亂和（或）尿酸排泄障礙所致的一組臨床癥候群，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石（Tophi）形成和關(guān)節(jié)畸形，嚴(yán)重者可致骨關(guān)節(jié)病變和關(guān)節(jié)活動障礙與畸形[1]。多與現(xiàn)代人飲食無度、酗酒、高嘌呤飲食、家族遺傳史、肥胖、創(chuàng)傷、手術(shù)及一些藥物的誘發(fā)有關(guān)。

目前常用于治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的化學(xué)藥主要有非甾體類抗炎藥（NSAIDs）、秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素等，其中秋水仙堿是治療急性發(fā)作的傳統(tǒng)藥物，其不良反應(yīng)較多，主要是胃腸道反應(yīng)；間歇期和慢性期則采用抑制尿酸生成藥、促尿酸排泄藥（如丙磺舒、苯溴馬隆、苯磺唑酮）等[2-4]。雖然這些化學(xué)藥品能有效控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及產(chǎn)生降尿酸作用，但均存在毒副作用較大，不良反應(yīng)多，易復(fù)發(fā)，價格昂貴或不宜長期服用等缺點。

中藥及天然藥物具有療效確切、毒副作用低，及多組分、多靶點綜合作用特點，是藥物發(fā)現(xiàn)的重要源泉，可從中藥及天然藥物資源中開發(fā)安全高效的治療痛風(fēng)的藥物。目前發(fā)現(xiàn)復(fù)方四妙散、二妙丸等經(jīng)典復(fù)方，以及萆薢、牛膝、土茯苓、秦艽、虎杖、大黃等單味中藥均具有良好的痛風(fēng)治療作用[5]。

紅花寄生為桑寄生科植物紅花寄生Scurrula parasitica Lour.的帶葉莖枝，在我國南部省區(qū)分布，常寄生于余甘、石榴、柚、山茶、夾竹桃等植物樹上，有補肝腎、祛風(fēng)濕、強筋骨之功效[6]。民間用于治療風(fēng)濕、胃痛、關(guān)節(jié)痛、高血壓、坐骨神經(jīng)痛、腰痛、胎動不安、產(chǎn)后乳少等[6]，在我國云南西雙版納州當(dāng)?shù)鼐用襁€用于治療痛風(fēng)相關(guān)癥狀。

然而，迄今為止，紅花寄生對治療痛風(fēng)的相關(guān)藥理作用仍未見報道。本文采用尿酸鈉誘導(dǎo)損傷的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠探究其藥理作用，為尋找用于痛風(fēng)防治的新型中藥以及云南特有民族藥物的研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 動物、材料、試劑及儀器

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠，體重量180±20 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（合格證號：SCXK（滇）k2015-0002）；實驗大鼠飼料購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，（合格證號：SCXK（滇）k2015-0003）。該實驗經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心倫理委員會審查合格（R-0620170010）。實驗前，所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，在適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，動物自由取食，自由飲水。飼養(yǎng)室內(nèi)保持安靜，室內(nèi)溫度維持在23-25℃，濕度55-75%，日光燈照明，每天24 h中保持12 h照明12 h黑暗。

1.2 試劑與材料

紅花寄生樣品采自云南西雙版納州勐海縣，樣品經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院胡海波老師鑒定為桑寄生科植物紅花寄生Scurrula parasitica L.，憑證標(biāo)本保存于昆明市代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室；苯溴馬隆購自江蘇省昆山龍燈瑞迪制藥有限公司（國藥準(zhǔn)字J20130141，規(guī)格：50 mg·片-1）；微晶型尿酸鈉（MSU）購自Sigma公司；吐溫-20（Tween-20）購自Biosharp科技有限公司；大鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）測定試劑盒購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素-8（IL-8）、黃嘌呤氧化酶（XOD）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；尿酸（UA）測定試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司；實驗用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備；其余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

T-5000型電子天平（d=0.1 g；常熟雙杰測試儀器廠）；BS-224電子天平（d=0.00001 g，北京賽爾利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；超聲波清洗機（14-1275；寧波新芝生物科技股份有限公司）；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；FD5-3型冷凍干燥機（美國金西盟國際集團）；TGL-16BS臺式微量離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HR/16M高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；UV-1800PC型紫外可見分光光度計（上海翱藝儀器有限公司）；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

2 實驗方法

2.1 紅花寄生提取物制備

將烘干（50℃）后的紅花寄生藥材粉碎，取粉末適量，加8倍量蒸餾水浸泡30 min，煎煮30 min（以煮沸時開始計算），過濾，收集濾液；殘渣再加水煮沸30 min，過濾，收集濾液；殘渣再加10倍量80%乙醇加熱回流60 min，過濾，收集濾液；合并3次濾液，減壓回收溶劑（50℃）；所得浸膏置于-80℃冰箱中結(jié)冰后，轉(zhuǎn)移至凍干機中，冷凍干燥得凍干粉。將凍干粉研碎，混勻，置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 痛風(fēng)動物模型復(fù)制及給藥

2.2.1 分組與給藥

36只大鼠隨機分6組，分別為對照組、模型組、陽性藥組、紅花寄生（高、中、低劑量）組，每組6只；對照組及模型組給予等體積蒸餾水，陽性藥組給予苯溴馬隆4.2 mg·kg-1，紅花寄生高、中、低劑量組分別給予4.0 g·kg-1、2.0 g·kg-1、1.0 g·kg-1紅花寄生提取物；其中紅花寄生高、中、低劑量組連續(xù)灌胃給藥10天，陽性藥組苯溴馬隆連續(xù)灌胃給藥2天，每天灌胃給藥1次，灌胃體積為10 mL·kg-1。

2.2.2 造模

末次給藥1 h后，將模型組、陽性藥組及紅花寄生低、中、高劑量組按照Mc Carty DJ經(jīng)典方法開始造模[7]：即用酒精局部消毒，將1 mL滅菌注射針于受試大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)從45°方向插入脛骨肌腱內(nèi)側(cè)，將0.05 mL尿酸鈉溶液（取0.5 g MSU，充分研細(xì)，加入9 mL生理鹽水和1 mL吐溫-80，加熱攪拌溶解即得）注入到踝關(guān)節(jié)腔造模，正常對照組注射0.05 mL無菌生理鹽水。

2.3 相關(guān)指標(biāo)檢測

2.3.1 裸關(guān)節(jié)腫脹度測定

每組大鼠分別于造模后0、2、4、8、12、24、48、72、96 h，采用傅線法測量右側(cè)踝關(guān)節(jié)同一部位周長，每只測3次，取平均值。

圖1 注射MSU 24 h后各組大鼠踝關(guān)節(jié)及足趾

表1 紅花寄生提取物對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)周長的影響

表1 紅花寄生提取物對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)周長的影響

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。

造模后踝關(guān)節(jié)周長/cm劑量/(g·kg-1)——0.0042 4.0 2.0 1.0組別對照組模型組陽性組高劑量組中劑量組低劑量組造模前踝關(guān)節(jié)周長/cm 2.18±0.04 2.28±0.07 2.27±0.07 2.14±0.06 2.23±0.08 2.23±0.05 2 h 2.21±0.09***2.77±0.14 2.47±0.08 2.70±0.08 2.70±0.05 2.72±0.09 4 h 2.45±0.13**2.80±0.19 2.78±0.10 2.64±0.11 2.63±0.10 2.69±0.06**8 h 2.47±0.13**2.84±0.08 2.79±0.17 2.89±0.13 2.81±0.11 2.78±0.11**12 h 2.46±0.08**2.84±0.14 2.81±0.08 2.89±0.13**2.74±0.21*2.87±0.14 96 h 2.46±0.07*2.64±0.10 2.57±0.06*2.53±0.15 2.41±0.12*2.52±0.11 24 h 2.42±0.10*2.70±0.07 2.65±0.14 2.87±0.08***2.79±0.15*2.74±0.11 48 h 2.53±0.09*2.82±0.13 2.77±0.07 2.77±0.15 2.69±0.09*2.69±0.12 72 h 2.58±0.11*2.68±0.09 2.55±0.06*2.65±0.07 2.60±0.08*2.65±0.12

2.3.2 血樣分析

于造模后96 h，用3.5%水合氯醛（0.1 mL·10 g-1）將大鼠麻醉解剖后，肝門靜脈取血4-5 mL，于4000 r·min-1，常溫離心10 min，分離出血清，按各試劑盒說明書操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定血清中IL-1β、IL-8、TNF-α、XOD及UA水平。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

3 實驗結(jié)果

3.1 紅花寄生提取物對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響

如圖1所示，在踝關(guān)節(jié)腔及足趾皮下注射MSU造模24 h后，與對照組相比，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)及足趾出現(xiàn)顯著紅腫和功能障礙（不能正常行走）；給予苯溴馬隆后，紅腫和功能障礙明顯減輕，雖與對照組大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)相比仍有些腫脹，但整體趨近于對照組；同苯溴馬隆一樣，給予紅花寄生提取物后，紅腫和功能障礙均有一定程度減輕，雖與對照組大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)比較仍有腫脹，但趨近于對照組，尤以中劑量組改善作用明顯。結(jié)果表明，紅花寄生提取物可有效減輕MSU造成的大鼠踝關(guān)節(jié)及足趾紅腫，并能改善功能障礙。

寄生茶提取物對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)周長的影響（表1），與正常對照組相比，模型組大鼠注射MSU后2 h，關(guān)節(jié)及足趾開始出現(xiàn)紅腫和功能障礙，發(fā)生率為100%，踝關(guān)節(jié)周長顯著增加（P＜0.05，P＜0.01，P ＜ 0.001），8-48 h達(dá)高峰期，在48 h后開始逐步消退。與模型組比較，苯溴馬隆組在72 h后可顯著降低大鼠踝關(guān)節(jié)周長（P＜0.05）；紅花寄生高、中、低劑量組在4-96 h的不同時間段均能不同程度降低降低大鼠踝關(guān)節(jié)周長（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。結(jié)果表明，紅花寄生提取物可有效降低大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度。

3.2 紅花寄生提取物對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α含量的影響（表2）

與正常對照組相比，大鼠造模后血清中IL-1β、IL-8和TNF-α含量均有明顯升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），提示MSU導(dǎo)致炎癥因子釋放，炎癥發(fā)生。與模型組相比，紅花寄生中劑量組和苯溴馬隆組能顯著降低血清中IL-1β、IL-8、TNF-α含量（P ＜0.05，P ＜0.01，P＜0.001）。結(jié)果表明，紅花寄生提取物可抑制MSU導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)而緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

3.3 紅花寄生提取物對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清尿酸、黃嘌呤氧化酶的影響（表3）

經(jīng)MSU溶液注射后，模型組大鼠血UA濃度顯著升高（P＜0.001），且模型組大鼠XOD活性明顯增加（P＜0.01），提示大鼠體內(nèi)嘌呤及尿酸代謝紊亂。與模型組比較，紅花寄生高、低劑量組和陽性藥組均能明顯降低血UA水平（P ＜0.05，P ＜0.01），紅花寄生高、中、低劑量組和陽性藥組均能降低XOD活性（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，紅花寄生提取物可有效降低XOD活性及血清UA含量而緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

表2 紅花寄生提取物對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、IL-8、TNF-α含量的影響（,n=6）

表2 紅花寄生提取物對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、IL-8、TNF-α含量的影響（,n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P ＜0.001。

TNF-α/(pg·mL-1)28.07±1.27***36.47±1.38 33.96±0.50*35.87±0.76 33.74±0.64*35.58±1.41組別對照組模型組陽性對照組紅花寄生高劑量組紅花寄生中劑量組紅花寄生低劑量組劑量/(g·kg-1)— —0.0042 4.0 2.0 1.0 IL-1β/(pg·mL-1)234.94±13.03**382.94±18.40 224.17±12.65**340.26±18.73 151.99±14.31***309.57±16.10 IL-8/(ng·L-1)72.89±1.74*80.93±1.01 68.11±0.45**85.74±2.70 72.92±2.58*82.13±0.51

表3 紅花寄生提取物對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中UA、XOD的影響（s,n=6）

表3 紅花寄生提取物對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中UA、XOD的影響（s,n=6）

注：與模型組比較，P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

XOD/U/L 5.24±0.66**8.47±0.31 5.58±0.58**4.02±0.29***5.39±0.56**6.61±0.46*組別對照組模型組陽性對照組紅花寄生高劑量組紅花寄生中劑量組紅花寄生低劑量組劑量/(g·kg-1)— —0.0042 4.0 2.0 1.0 UA/(μmol·L-1)21.43±4.41***52.56±2.44 39.76±2.82*28.94±2.08**46.12±3.43 29.86±5.69**

4 討論

痛風(fēng)是MSU由沉積在關(guān)節(jié)周圍而引起的一種炎癥，臨床以關(guān)節(jié)劇痛伴腫脹發(fā)熱暗紅為主要表現(xiàn)。MSU注射踝關(guān)節(jié)腔后可致大量炎性細(xì)胞浸潤，受試關(guān)節(jié)周徑明顯增大，腫脹嚴(yán)重，正常行走步態(tài)明顯改變[8]。因此，本文采用MSU誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型（Mc Carty DJ經(jīng)典造模方法），并以苯溴馬隆為陽性藥（可抑制腎小管對尿酸的再吸收而降低血中尿酸，進而緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[9]）探討紅花寄生提取物對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的干預(yù)作用。研究表明，小鼠雌雄動物之間血清UA正常值差異較大[10]，故本文僅選用雄鼠。

痛風(fēng)最典型的臨床癥狀是突發(fā)性足趾關(guān)節(jié)的紅、腫、劇烈疼痛等一系列急性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)[11,12]。本文研究發(fā)現(xiàn)，在踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU后，大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度顯著增加，而紅花寄生提取物高、中、低劑量組能在不同時段不同程度抑制其大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），說明紅花寄生可有效緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的核心是中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥，增強的中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏連是急性痛風(fēng)產(chǎn)生的本質(zhì)，炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α等在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的免疫和病理過程中發(fā)揮重要作用[9]。研究表明，抗TNF-α能明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的激活和中性粒細(xì)胞募集，從而抑制炎癥反應(yīng)，降低急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)組織局部IL-1β、IL-8和TNF-α水平，可能終止炎性細(xì)胞因子的惡性循環(huán)[13]。本文研究發(fā)現(xiàn)，MSU可顯著增加IL-1β、TNF-α及IL-8水平，而中劑量紅花寄生提取物能顯著降低這些炎癥因子的水平（P＜0.05，P＜0.001），表明紅花寄生可有效抑制MSU引發(fā)的炎癥反應(yīng)而緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

XOD是體內(nèi)催化黃嘌呤、次黃嘌呤氧化生成尿酸的酶，而血UA升高是痛風(fēng)的重要生化基礎(chǔ)，二者均是痛風(fēng)發(fā)生發(fā)展的體內(nèi)重要標(biāo)志物[14]。本研究表明，MSU顯著升高XOD活力，且血UA也隨之顯著升高；而給予低、高劑量紅花寄生提取物后，二者水平均顯著降低（P ＜0.05，P ＜0.01，P＜0.001），且其高劑量的效果優(yōu)于苯溴馬隆。說明紅花寄生可有效抑制XOD活力，降低血UA而緩解MSU誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

綜上所述，紅花寄生可緩解MSU誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)癥狀。其機制可能與抑制炎癥反應(yīng)，抑制XOD活力及促進UA排泄有關(guān)。另外發(fā)現(xiàn)，本研究選取的紅花寄生高、中、低三個劑量的藥效指標(biāo)與劑量沒有成明顯劑量依賴關(guān)系，這可能是由于天然藥物中復(fù)雜的化學(xué)成分及復(fù)雜作用機制（多途徑、多靶點及疊加等方式整合作用）導(dǎo)致的，且這種非線性特點亦存在其他天然產(chǎn)物中[15]；也可能是本研究給藥劑量沒有在能體現(xiàn)劑量依賴關(guān)系的劑量范圍內(nèi)。本研究結(jié)果可為紅花寄生臨床應(yīng)用、資源開發(fā)及創(chuàng)新藥品/健康產(chǎn)品研發(fā)等提供科學(xué)依據(jù)，同時也為深入探討紅花寄生 緩解痛風(fēng)的作用機制夯實基礎(chǔ)。