美洲大蠊提取液對大鼠難愈合創面TGF-β1/Smads通路調控機制的研究＊

曾娟妮，劉 筱，耿越飛，沈詠梅，何永恒＊＊

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院 長沙 410000；2.湖南中醫藥大學 長沙 410208；3.成都高新好醫生第一醫院 成都 610202）

有研究表明[1-3]，Smads通路（Smads route）是TGF-β 1調節成纖維細胞合成ECM及凋亡的細胞內主要信號轉導通路，是新近發現的TGF-β受體復合物下游一類非常重要的信號傳導分子家族。Smad3介導的信號途徑在體內抑制創傷愈合；Smad7[4]蛋白屬于抑制型Smad家族成員，能降低TGF-β1的生物學效應，減少成纖維細胞的增殖，減少瘢痕形成。相關研究表明組織創傷愈合與肉芽組織的形成有很大關聯，新的肉芽組織對創口的閉合有很大促進作用[5]。筆者前期將美洲大蠊提取液外用于肛管難愈合創面，取得滿意療效[6]。通過PCR實驗研究發現美洲大蠊提取液能提高難愈合創面中VEGF的表達而加速創面的修復[7]。免疫組化實驗研究表明美洲大蠊提取液能提高大鼠難愈合創面中TGF-β的表達，從而促進創面愈合[8]。但美洲大蠊提取液促進創面愈合的機制仍不清楚。本實驗旨在觀察創面肉芽組織中TGF-β1和Smad3、Smad7及其磷酸化的表達，從分子水平探討該藥促進創面愈合的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠（SPF Wistar Rat）60只，雄性，2月齡，體質量200-250 g，由湖南景萊克景達實驗動物有限公司提供（動物許可證號：SCXK（湘）2013-0005，動物合格證編號NO.43004700015135）。

1.2 藥品與試劑

貝復濟15 mL·瓶-1（珠海億勝生物制藥有限公司，國藥準字S10980075）；美洲大蠊提取液100 mL·瓶-1（商品名：康復新液，四川好醫生攀西藥業有限責任公司，國藥準字Z51021834）。RIPA蛋白裂解液、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、超敏化學放光顯色試劑盒（江蘇碧云天）；彩色預染蛋白marker（Fermentas）；5X SDSPAGE loading buffer、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（vazyme）。

1.3 實驗儀器

電泳儀、垂直板電泳槽、水平電轉槽、水平搖床（北京六一儀器廠）；恒溫搖床金壇）；超純水儀（millipore公司）；紫外可見分光光度計（上海spectrum公司）；臺式高速冷凍離心機（Thermo）；壓片夾（koda）；掃描儀（日本Canon）。

1.4 方法

1.4.1 造模與分組

將60只雄性Wistar大鼠采用隨機數字表法分為急性全層皮膚缺損組（空白組）、模型組、貝復濟對照組（對照組）、美洲大蠊提取液實驗組（實驗組），每組15只。采用全層皮膚缺損+激素法制成大鼠慢性難愈合創面模型[9]，用20%烏拉坦（5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠后，在其背中部脊柱兩側旁開1 cm，距肩胛骨以下2 cm用外科方法作兩條深達筋膜、直徑為18 mm的全層皮膚缺損開放性創面；模型組、對照組、實驗組造模后即刻皮下注射醋酸氫化可的松（6 mg·100 g-1）。

1.4.2 換藥及取材

空白組與模型組外敷層0.9%氯化鈉溶液（0.2 mL·cm-2）紗布；對照組用貝復濟（60 μ·cm-2）浸透的單層紗布外敷于創面；實驗組以美洲大蠊提取液（0.2 mL·cm-2）浸透后的單層紗布外敷于創面。然后在創面上加蓋兩層消毒干紗布，用膠布“豐”字形固定，每日定時換藥2次。各組在藥物干預3天、8天、15天、20天后隨機取3只大鼠造模區深達真皮全層的創面組織備試管固定液中待用，所有大鼠在20 d取材后統一處死。

1.4.3 免疫組化測定

將固定的肉芽組織標本進行脫水，再浸蠟，然后包埋，最后切片。取4 μm石蠟切片，進行脫蠟脫水后，用PBS洗滌，每次3 min，共3次；然后3%H2O2：室溫下20 min，PBS洗滌，每次3 min，共3次；再將切片浸入0.01 mol·L-1pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液，微波爐（98℃）進行抗原修復2次，每次10 min，然后取出在室溫下自然冷卻后滴加一抗，放4℃冰箱過夜；PBS洗滌3次，每次3 min，滴加Envision試劑，在37℃下30 min，PBS洗滌3次，每次3 min，用0.04%DAB+0.03%H2O2顯色8 min后用蘇木素襯染、鹽酸乙醇藍化2 s進行流水洗，最后微波藍化后用樹脂封片。檢測目標以胞漿出現棕黃色或棕褐色顆粒者判定為陽性細胞，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.4.4 Western blot檢測（Western Blot Test）

將所取組織塊置于1-2 mL勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進行勻漿，然后置于冰上，30 min后用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，然后在4℃下12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中并置于-20℃保存，考馬亮藍染色測定樣品濃度并調整各上樣量至50 μg，加入2×加樣緩沖液，煮沸3 min后取上樣。在制備好的8%的SDS、PAGE凝膠上行垂直電泳分離。NC膜電轉移轉印跡。以含5%脫脂奶粉rIBS—T溶液(10 mmol/1。'l'ris-CI，100 retool/L NaCl+0.1%Tween 20)封閉，而后分別加入羊抗大鼠Smad3和Smad7多克隆抗體(1∶500稀釋)，再以辣根過氧化物酶（HRPO）偶聯兔抗羊lgG抗體（I∶1 000稀釋）孵育，以上步驟間用TBS—T常溫下充分洗膜。最后用ECL系統感光顯像。

1.4.5 統計學方法

使用SPSS23.0統計軟件，數據以x±s表示，滿足方差齊性檢驗，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，若方差不齊，采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 免疫組化結果

2.1.1 TGF-β1結果

空白組、實驗組3-8天逐漸上升，8-20天逐漸下降，8天表達最高；模型組、對照組3-20 d無明顯規律性。3天，空白組較模型組（P=0＜0.01）、對照組（P=0.018＜0.05）表達高，與實驗組無差異（P=0.076＞0.05），8天、15天、20天，高于模型組（P=0.011＜ 0.05，P=0.037＜0.05，P=0.005＜0.05），與對照組（P=0.206 ＞ 0.05，P=0.361＞ 0.05，P=0.511 ＞ 0.05）、實驗組無差異（P=0.597＞0.05，P=0.409＞0.05，P=0.280 ＞ 0.05）；3 d、8 d、15 d、20 d，實驗組較模型組（P=0.006＜ 0.01，P=0.005＜ 0.01，P=0.010＜ 0.05，P=0.001＜0.01）表達高，與對照組無差異（P=0.376＞0.05，P=0.090 ＞ 0.05，P=0.103 ＞ 0.05，P=0.102 ＞0.05）（表1，圖1）。

表1 TGF-β1表達水平（平均比值TGF-β1/actin，

表1 TGF-β1表達水平（平均比值TGF-β1/actin，

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對照組。

20天72392.879±6273.675△16261.572±971.983▲*62451.804±25231.010△89135.549±23961.546△9.341組別空白組模型組對照組實驗組F值n 15 15 15 15 3天83525.117±16742.699△*21064.629±3595.978▲*51431.138±15225.560▲△61532.321±13126.405△11.582 8天93309.969±37601.725△18576.629±3841.071▲62009.998±24227.199 105820.48±33024.642△5.839 15天78774.331±29284.824△23759.483±10523.659▲57534.231±37615.652 97907.714±22504.281△4.192

圖1 4組TGF-β1、Smad3、Smad7免疫組化圖

2.1.2 Smad3結果

空白組、模型組3-20天逐漸上升，對照組、實驗組逐漸下降。3天、8天，空白組與模型組（P=0.090＞0.05，P=0.124＞ 0.05）、對照組（P=0.127＞ 0.05，P=0.936＞0.05）、實驗組（P=0.131＞0.05，P=0.470＞0.05）比較均無差異，15天、20天，較模型組（P=0.016＜0.05，P=0.000＜0.05）表達低，與對照組（P=0.573＞0.05，P=0.394＞0.05）、實驗組無差異（P=0.807＞0.05，P=0.131＞0.05）。3天，實驗組與模型組（P=0.810＞0.05）、對照組（P=0.985＞0.05）無差異，8天、15天，較模型組（P=0.038＜0.05，P=0.024＜0.05）表達低，與對照組（P=0.425＞ 0.05，P=0.747＞0.05）無差異，20天，較模型組（P=0.000＜ 0.05）、對照組（P=0.032＜0.05）均表達低（表2，圖1）。

2.1.3 Smad7結果

空白組、對照組、實驗組3-20d逐漸下降，模型組逐漸上升。3天、8天、15天、20天，空白組較模型組（P=0.006＜ 0.05，P=0.003＜ 0.05，P=0.000＜ 0.05，P=0.034＜0.05）表達低，與對照組（P=0.384＞0.05，P=0.883 ＞ 0.05，P=0.230 ＞ 0.05，P=0.939 ＞ 0.05）、實驗組（P=0.351＞0.05，P=0.819＞0.05，P=0.134＞0.05，P=0.906＞0.05）無差異，實驗組均顯著低于模型組（P=0.001＜ 0.05，P=0.002＜ 0.05，P=0.000＜0.05，P=0.028＜0.05），與對照組（P=0.947＞0.05，P=0.934＞ 0.05，P=0.722＞ 0.05，P=0.845＞ 0.05）無差異（表3，圖1）。

表2 Smad3表達情況（平均值Smad3/actin，

表2 Smad3表達情況（平均值Smad3/actin，

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對照組。

20天41269.992±8205.107△100522.621±13038.594▲*47457.652±6698.329△29710.137±825.310*△41.813組別空白組模型組對照組實驗組F值n 15 15 15 15 3天22612.791±14350.346 58752.752±23192.982 54453.484±22099.670 54101.921±29515.078 1.593 8天43378.052±35766.782 73997.794±19272.023 44851.124±7930.386 29861.459±13845.585△2.175 15天37974.528±18979.562△118962.615±57506.854▲*53691.842±23716.857△44746.892±8389.019△3.884

表3 Smad7表達情況（平均值Smad7/actin，

表3 Smad7表達情況（平均值Smad7/actin，

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對照組。

20天14773.743±8639.168△116536.588±96902.748▲*17938.908±3838.563△9902.136±4038.100△3.322組別空白組模型組對照組實驗組F值n 15 15 15 15 3天39777.056±25870.388△93882.519±20520.756▲*26486.450±8204.196△25489.137±9498.545△10.040 8天22523.865±16282.681△85775.809±32313.052▲*20261.077±3513.526△18988.951±4460.120△9.521 15天31685.206±15674.246△97811.086±10564.203▲*20397.770±7877.807△17189.495±5794.842△38.004

表4 TGF-β1表達水平（平均比值TGF-β1/actin，x

表4 TGF-β1表達水平（平均比值TGF-β1/actin，x

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對照組。

20 d 0.702±0.009△*0.356±0.021▲*0.533±0.036▲△0.534±0.037△72.698組別空白組模型組對照組實驗組F值n 15 15 15 15 3 d 0.686±0.003△*0.410±0.011▲0.425±0.027▲0.461±0.011▲△*195.164 8 d 0.671±0.019△*0.388±0.105▲*0.626±0.135▲△0.637±0.150▲△224.817 15 d 0.689±0.005△*0.380±0.320▲*0.641±0.006▲△0.698±0.008△*233.579

2.2 Western blot結果

2.2.1 TGF-β1結果

TGF-β1表達水平比較，空白組3-20天逐漸上升，模型組逐漸下降，對照組與實驗組3-15天逐漸上升，15-20天逐漸下降；空白組3天、8天、15天、20天較其他三組表達高（P＜0.05）；實驗組3天、15天，較模型組（P=0.005＜0.05，P=0.000＜0.05）、對照組（P=0.027＜ 0.05，P=0.003＜ 0.05）表達高，8天、20天，較模型組（P=0＜0.01，P=0＜0.01）表達水平高，與對照組無差異（P=0.409＞ 0.05，P=0.967＞ 0.05）（表4，圖2，圖3）。

2.2.2 Smad3結果

Smad3的表達水平比較，3-20天均逐漸升高?？瞻捉M3天、15天，與模型組（P=0.095＞0.05，P=0.060＞0.05）、對照組（P=0.102＞0.05，P=0.171＞0.05）、實驗組（P=0.818＞0.05，P=0.773＞0.05）無差異，8天，較模型組（P=0.011＜0.05）、對照組（P=0.024＜0.05）表達低，與實驗組無差異（P=0.305＞0.05），20天，較模型組（P=0.043＜ 0.05）表達低，與對照組（P=0.075＞0.05）、實驗組（P=0.499＞0.05）無差異；實驗組3天、8天、15天、20天，與模型組（P=0.137 ＞ 0.05，P=0.059 ＞ 0.05，P=0.096 ＞ 0.05，P=0.129＞0.05）、對照組（P=0.147＞0.05，P=0.131＞0.05，P=0.262＞ 0.05，P=0.217＞ 0.05）均無統計學意義（表5，圖2，圖3）。

表5 Smad3表達水平（平均值Smad3/actin，x）

表5 Smad3表達水平（平均值Smad3/actin，x）

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對照組。

20d 71.680±14.030△88.393±1.925▲85.920±0.130 76.606±9.464 2.544組別空白組模型組對照組實驗組F值n 15 15 15 15 3 d 65.526±2.670 75.133±5.985 74.890±9.770 66.733±4.040 2.059 8 d 67.250±11.630△*83.250±1.140▲80.725±1.425▲72.570±1.610 4.624 15 d 72.350±12.230 85.186±3.485 81.193±1.395 74.100±6.580 2.103

表6 Smad7表達水平（平均值Smad7/actin，

表6 Smad7表達水平（平均值Smad7/actin，

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對照組。

20 d 56.860±5.710△72.290±10.610▲*59.401±5.435△57.300±3.070△3.475組別空白組模型組對照組實驗組F值n 15 15 15 15 3 d 49.133±0.835△66.633±16.555▲52.890±1.165 50.333±2.265△2.784 8 d 62.381±12.288 70.840±11.920 58.970±4.170 56.035±4.715 1.479 15 d 63.860±4.900△76.470±9.080▲*59.595±3.875△59.396±4.080△9.005

2.2.3 Smad7結果

Smad7的表達水平比較，3-15天逐漸上升，15-20天逐漸降低?？瞻捉M3天、15天、20天，較模型組（P=0.034 ＜ 0.05，P=0.002 ＜ 0.05，P=0.024 ＜ 0.05）表達低，與對照組（P=0.598＞0.05，P=0.584＞0.05，P=0.659＞0.05）、實驗組（P=0.865＞0.05，P=0.282＞0.05，P=0.939＞ 0.05）無差異，8天，比模型組（P=0.289＜0.05）、對照組（P=0.659＜0.05）表達低，與實驗組無差異（P=0.419＞0.05）；3天、8天，實驗組與模型組（P=0.044＞0.05，P=0.082＞0.05）、對照組（P=0.719＞ 0.05，P=0.704＞ 0.05）比較無差異，15天、20天，比模型組（P=0.007＜0.05，P=0.027＜0.05）表達低，與對照組（P=0.575＞0.05，P=0.714＞0.05）無差異（表6，圖2，圖3）。

2.2.4 psmad3結果

psmad3表達水平比較，空白組3-15天逐漸降低，模型組逐漸升高，對照組、實驗組3-8天逐漸升高，8-20天逐漸降低?？瞻捉M3天、15天、20天，較模型組（P=0.005 ＜ 0.05，P=0.000 ＜ 0.05，P=0.000 ＜ 0.05）表達低，與對照組（P=0.145＞0.05，P=0.478＞0.05，P=0.355＞0.05）、實驗組（P=0.391＞0.05，P=0.498＞ 0.05，P=0.950＞0.05）無差異，8天，與模型組（P=0.098＞0.05）、對照組（P=0.458＞0.05）、實驗組均無差異（P=0.231＞ 0.05）；實驗組3天、15天、20天，較模型組（P=0.001＜0.05，P=0.000＜0.05，P=0.000＜0.05）表達低，與對照組（P=0.500＞0.05，P=0.184＞0.05，P=0.325＞0.05）無差異，8天，與模型組（P=0.583＞0.05）、對照組（P=0.618＞0.05）均無差異（表7，圖2，圖3）。

表7 psmad3表達水平（平均比值psmad3/actin，

表7 psmad3表達水平（平均比值psmad3/actin，

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對照組。

20天0.263±0.093△0.802±0.008▲*0.222±0.028△0.275±0.024△87.490組別空白組模型組對照組實驗組F值n 15 15 15 15 3天0.310±0.005△0.424±0.050▲*0.262±0.499△0.283±0.014△11.781 8天0.284±0.995 0.432±0.026 0.345±0.128 0.386±0.102 1.262 15天0.263±0.082△0.747±0.033▲*0.228±0.068△0.295±0.014△56.155

2.2.5 psmad7結果

psmad7表達水平比較，空白組3-8天逐漸降低，8-20天逐漸升高，模型組3-20天逐漸升高，對照組、實驗組3-20天逐漸降低?？瞻捉M3天、8天、20天，較模型組（P=0.007＜0.05，P=0.009＜0.05，P=0.000＜0.05）表達低，與對照組（P=0.062＞0.05，P=0.070＞0.05，P=0.246＞ 0.05）、實驗組（P=0.186＞ 0.05，P=0.077＞ 0.05，P=0.141＞0.05）無差異，15天，比模型組（P=0.000＜0.05）、對照組（P=0.003＜0.05）、實驗組（P=0.004＜0.05）表達低；3天、8天，實驗組與模型組（P=0.066＞0.05，P=0.200＞0.05）、對照組（P=0.493＞0.05，P=0.955＞0.05）比較無差異，15天、20天，較模型組（P=0.000＜0.05，P=0.000＜0.05）表達低，與對照組（P=0.915＞0.05，P=0.711＞0.05）無差異（表8，圖2，圖3）。

3 討論

難愈合創面是指創面在各種內外因素作用下不能通過正常的愈合進程達到解剖和功能上的完整，從而進入一種病理性炎癥反應狀態，最終導致經久難愈[10]。

現代藥理研究證明美洲大蠊提取液能促進肉芽組織生長，促進血管增生，加速壞死組織脫落，迅速修復各類潰瘍及創傷創面；抗感染、消除炎性水腫，提高機體免疫功能；外用可快速激活局部免疫細胞，縮短創面愈合時間[11,12]。貝復濟是一種堿性成纖維化細胞生長因子[13]，其在血管生成的過程中有很大作用。

表8 psmad7表達水平（平均比值psmad7/actin

表8 psmad7表達水平（平均比值psmad7/actin

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對照組。

20天0.397±0.045△1.032±0.151▲*0.479±0.017△0.504±0.196△39.469組別空白組模型組對照組實驗組F值n 15 15 15 15 3天0.328±0.014△0.871±0.293▲0.657±0.226 0.548±0.026 4.438 8天0.295±0.002△0.883±0.186▲0.644±0.269 0.644±0.262 3.993 15天0.319±0.048△*0.917±0.124▲*0.538±0.005▲△0.544±0.002▲△41.200

創傷后TGF-β參與了皮膚愈合的炎癥期、肉芽組織形成期和瘢痕形成期全過程。TGF-β對單核細胞、中性粒細胞具有很強的趣化作用，引起炎癥細胞的局部募集，分泌細胞生長因子等促進創面愈合；TGF-β還能趨化并作用于成纖維細胞，刺激多種基質蛋白如纖維粘連蛋白和膠原基因的轉錄。并可通過調節蛋白酶的表達抑制基質降解；刺激成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，促進創口收縮。Smad是轉化生長因子β（TGF-β）胞內信號轉導通路中的重要組成部分，它可以將TGF-β信號直接由細胞膜通過TβRⅠ、TβRⅡ受體結合形成的復合物，使其自身被磷酸化，并通過誘導結合形成的復合物轉運至細胞核內。當細胞受到TGF-β刺激時，Smads與β-微管蛋白分離，Smad2或Smad3就會與SARA蛋白結合，被呈遞給TGF-β受體復合物而被活化[14,15]。內源性的Smad7表達受TGF-β誘導，也可由作用于內皮細胞的液體剪切力誘導表達[16]。蘇麗婷等[17]研究發現Smad7蛋白有抑制TGF-β信號轉導的作用，Smad7屬于抑制型Smad，可以通過干擾Smad磷酸化[18]，影響TGF-β超家族信號通路的傳導。

本研究結果顯示，兩種實驗方法均表現為空白組創面愈合速度最快，模型組愈合緩慢，表明慢性難愈合創面的愈合速度明顯低于一般的創面。免疫組化發現實驗組與模型組TGF-β1、Smad7的表達比較有統計學意義（P＜0.05），Smad3的表達結果顯示實驗組與模型組比較，3天無明顯差異（P ＞0.05），8天、15天、20天有統計學意義（P＜0.05）。Western blot實驗顯示TGF-β 1、Smad7、psmad3的表達，實驗組與模型組比較有統計學意義（P＜0.05）；各組間Smad3的表達比較均無統計學意義（P＞0.05），psmad7的表達結果顯示，實驗組與模型組比較，3-8天無統計學意義（P＞0.05），15-20天有統計學意義（P＜0.05）。美洲大蠊提取液能通過降低Smad7的表達，減少Smad7的自身磷酸化來提高TGF-β1的表達，從而促進創面愈合；Smad3結果顯示3-20天均逐漸上升，各組間比較均無統計學意義（P＞0.05），psmad3的表達結果發現空白組3-15天逐漸降低，模型組逐漸升高，對照組、實驗組3-8天逐漸升高，8-20天逐漸降低，實驗組與模型組比較有統計學意義（P＜0.05），表明美洲大蠊提取液下調Smad3的現象不顯著，但能引起Smad3的磷酸化。

綜上所述，本次研究結果提示美洲大蠊提取液下調Smad3的現象不顯著，而能有效降低Smad7的表達，減少Smad7的自身磷酸化，從而減弱Smad7對TGF-β1信號轉導的抑制，提高TGF-β1的表達而促進創面愈合。進一步證實了運用美洲大蠊提取液后，慢性難愈合創面與一般創面的愈合速度差異不明顯，為中醫外治法提供了新的方法和思路。