基于網絡藥理學方法的左金丸治療結直腸癌的作用機制分析＊

潘秋莎，楊夢蝶，呼雪慶，趙 明,2，蘇式兵＊＊

（1.上海中醫藥大學交叉科學研究院 上海 201203；2.AntiCancer,Inc.圣地亞哥 92111）

左金丸，又名“萸連丸”。首載于《丹溪心法》,為金元著名醫家朱丹溪所創，方中重用苦寒之黃連為君,佐以辛熱之吳茱萸,清泄肝火,降逆止嘔。左金丸藥理學研究表明其在潰瘍性結腸炎、胃粘膜損傷中良好的效果[1]。近年來有研究表明左金丸在結直腸癌的治療和研究中有突出的表現，其單體成分小檗堿、吳茱萸堿和槲皮素等更是在結直腸癌（colorectal cancer,CRC）的實驗研究中有明顯抑制腫瘤細胞的生長和增殖，促進腫瘤細胞凋亡、抑制癌基因表達等作用[2]。

網絡藥理學從系統生物學的角度出發,融合了多向藥理學的思想，結合計算機技術，通過構建生物分子網絡，分析和預測中藥及復方治療疾病中多成分、多靶點及多途徑的機制研究[3,4]。利用中藥靶標及藥理活性預測，通過建立藥物-靶點-疾病之間的相互關系進行分析，可以揭示藥物作用于人體的效應機制[5,6]。本研究通過多種公共數據平臺，運用網絡藥理學的分析方法，獲取左金丸和結直腸癌的相關信息。構建左金丸作用于結直腸癌的成分-靶點-疾病的網絡結構，揭示左金丸治療結直腸癌的潛在作用機制，并為左金丸的臨床應用提供理論依據，為中藥及中藥復方的藥理作用、效應機制提供新的研究思路和方法。

1 材料與方法

1.1 左金丸活性成分及靶點篩選

本研究依托中藥綜合數據庫分析平臺TCMSPlsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php[7]；HIT（http://lifecenter.sgst.cn/hit）[8]；TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid）[9]；TCMdatabase@taiwan（tcm.cmu.edu.tw）[10]，檢索收集左金丸中黃連、吳茱萸的化學成分，按照口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%和化合物類藥性(Druglikeness，DL)≥0.18進行篩選，得到即為左金丸的的活性成分。OB是指藥物分子通過口服的方式進入人體循環系統能力的重要參數，同時也是作為藥物篩選過程及分子類藥性的一個重要指標[11]；DL的閾值篩選通常用于藥物研發中，可將高質量的先導化合物從大量的化合物分子庫中篩選出進而提高藥物設計的精準率[12]。 通 過 數 據 庫 TCMSP、Drugbank（http://www.drugbank.ca）[13]檢索活性成分對應的人類靶蛋白，通過該數據庫 SIB（http://www.swisstargetprediction.ch）[14]、SEA（http://sea.bkslab.org/）[15]進行化學結構相似性擴展,篩選相對應的人類靶蛋白。將以上得到的靶點合并去重，刪掉無對應的靶點及成分。通過軟件Cytoscape 6.1（http://www.cytoscape.org）[16]構建左金丸成分-靶點網絡，按照大于Degree平均值為卡值，進一步構建左金丸的核心成分-靶點網絡。

1.2 結直腸癌疾病靶點收集

數據庫DisGeNET（www.disgenet.org）[17];OMIM（http://www.omim.org）[18]；OUGene（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/OUGene）[19]等涵蓋了人類遺傳疾病信息及治療疾病的藥物信息，通過疾病名稱或癥狀關鍵詞搜索可獲得疾病或癥狀的靶點信息，檢索提取其相關的靶基因。

1.3 構建左金丸治療結直腸癌的功能靶點

將預測所得的左金丸靶點蛋白及結直腸癌靶基因相互交集，與預測所得的核心靶點，合并去重后得到的靶點導入String數據庫（https://string-db.org/Version10.5）[20],獲得蛋白互作關系，構建PPI網絡,將數據保存為TSV格式。將文件中node1、node2和Combined score信息導入Cytoscape6.1中。Cytoscape是一個開放源碼的生物信息分析軟件。通過其Network Analyzer功能分析，以大于中介中心（Betweenness）和節點介度（Degree）平均值為卡值，對上述的數據進行分析，構建左金丸作用于結直腸癌的功能靶點網絡。

節點介度，又稱為連通性，是一個基因擁有邊（調控關系）的數量，網絡結構中節點（note）的大小與度成正比關系，節點越大，表示與此節點相連的邊越多，即與這個基因的關聯性更大[21]。中介中心，是一個結點擔任其它兩個結點之間最短路的橋梁的次數，反映在網絡中某一節點與其他節點之間的接近程度。通常以最短路徑數量計算，設節點s和節點t，用d(s,t)表示節點s到節點t的距離,δst表示節點s到節點t的最短路徑數量δst（v）表示節點s到節點t的最短路徑中經過節點v的數量，所以經過v點的路徑數量為:∑δst(μ)/δst[22]。

1.4 構建左金丸治療結直腸癌的成分-靶點-通路網絡

利用在線工具 Davaid6.7（https://david.ncifcrf.gov）[23]對篩選所得的核心靶點進行基因本體GO生物學功能富集分析和KEGG通路富集分析。所得值按按Bonferroni法校正后，P＜0.01篩選。為了能直觀闡述左金丸治療結直腸癌的作用機制，選取P值排名前二十的通路信息構建左金丸的活性成分-靶點-通路的網絡結構。分析其網絡拓撲參數結構，構建左金丸部分成分-靶點-通路圖，闡釋左金丸作用于結直腸癌的作用機制。

2 結果

2.1 左金丸活性成分及其靶點的篩選

經過對左金丸化學成分收集，得到234種化合物，其中黃連62種、吳茱萸172種。篩選后得共41種活性成分,黃連15種,吳茱萸26種,主要有槲皮素、β淄谷醇、異鼠李素、吳茱萸堿、小檗堿等。其共有成分包括了小檗 堿（Berberine）、槲 皮 素（Quercetin）及 黃 柏 酮（Obacunone）3種。

在TCMSP、Drugbank中查找41個成分對應的人類靶蛋白，得到靶蛋白360個。其中黃連162個，吳茱萸198個。通過SEA和SIB數據庫，對活性成分進行成分相似性擴展靶點預測，得到281個靶點，全部合并去重后得到482個靶點，其中黃連共有224個，吳茱萸有262個，刪除無靶點對應的成分，得到36個活性成分。運用軟件Cytoscape6.1構建左金丸成分-靶點網絡（圖1A）。該網絡結構共有610條邊，共522個節點，結構平均節點度為3.86，其中有36個節點為左金丸的活性核心成分。進一步，結構建核心成分-靶點網絡，按照中介中心度（Betweenness）和節點介度（Degree）平均值篩選，得到72個核心靶點，構建左金丸的核心成分-靶點網絡（表1，圖1B）。

2.2 結直腸癌的疾病基因

在數據庫 GENenNET、OMIM、OUGene中輸入“colorectal cancer”查找與其有關的基因蛋白信息，收集合并得到737個靶基因。

圖1 左金丸成分-靶點網絡

2.3 構建左金丸治療結直腸癌的功能靶點網絡

將上述左金丸預測所得482個靶點與結直腸癌的737疾病基因，通過維恩分析得到共有靶點58個（圖2A）。將其與預測分析所得核心靶點合并去重后得到120個靶點蛋白，通過數據庫String，分析蛋白之間的相互關系，構建PPI網絡。再通過Cytoscape6.1對所得數據進一步分析，選取大于中介中心（Betweenness）和節點介度（Degree）的平均值，得到50個靶點蛋白，即為左金丸作用于結直腸癌的功能靶點。構建左金丸治療結直腸癌的潛在功能靶點網絡（圖2B），網絡中節點越大，其Degree值越高，意味著與結直腸癌的關系更為密切。排名靠前涉及靶點有PIK3CA、AKT1、TP53、HIF-1α、BAX、MYC、CCND1、EGFR、STAT3、MMP9等。

表1 左金丸活性成分

2.4 左金丸作用于結直腸癌的成分-功能靶點-通路網絡

利用平臺Davaid6.8對左金丸治療結直腸癌的潛在功能靶點進行基因功能及通路分析。得到基因GO本體條目283條，涉及核質、細胞凋亡、基因表達調控等方面，基因百科全書（KEGG）通路58條，將P值排名前二十的功能信息展示（表2）。結果顯示：左金丸的活性成分主要富集在細胞增殖正調節、凋亡過程的負調控、蛋白質磷酸化正調控、細胞遷移正調控、RNA聚合酶II啟動子轉錄的調控等生物過程；細胞組成方面主要富集在細胞質、核質等方面；分子功能主要涉及了蛋白質結合、蛋白激酶結合及轉錄因子結合等。其通路主要富集在癌癥途徑、乙型肝炎、癌癥中的蛋白多糖、HIF-1信號通路、PI3K-AKT信號通路、HTLV-1感染通路、結直腸癌、膠質瘤、FoXO信號通路等。通過Cytoscape6.1構建左金丸成分-作用靶點-通路網絡（圖2C）。

2.5 左金丸部分成分-靶點-通路分析

構建左金丸治療結直腸癌的成分靶點通路，結合文獻將預測所得左金丸作用于結直腸癌的功能靶點，及其對應的成分、通路通過示意圖綜合展示（圖3）。如圖所示，圖中綠色箭頭表示促進作用，紅色的T線表示抑制作用，黃色的圓形表示左金丸作用于結直腸癌

的作用靶點，綠色圓形表示通路的靶點，藍色箭頭表示靶點對應的成分，白色框內表示相關通路。

表2 顯著富集前二十條生物過程和KEGG(Р＜0.01)

圖3 左金丸治療結直腸癌的部分功能靶點通路

實驗研究表明，左金丸抗腫瘤的機制是多成分、多靶點、多途徑作用的。研究觀察槲皮素對結腸癌細胞系RKO影響，發現其可通過上調P21和P27的表達使細胞周期阻滯與G0/G1期，上調凋亡蛋白p53，誘導RKO細胞發生凋亡[24]；使用槲皮素處理人結腸癌細胞SW480，結果表明其可以明顯抑制細胞中Bcl-2，C-myc的表達水平，進而抑制了腫瘤細胞的的侵襲和轉移[25,26]。因而，在不同的細胞中，槲皮素的作用機制及途徑各不相同，但主要是通過下調癌癥相關基因，上調抗癌基因從而誘導細胞發生凋亡。β淄谷醇具有抗腫瘤活性，但其與結直腸癌之間的研究甚微，有研究發現β-淄谷醇能抑制人結腸腺癌細胞COLO320中βcatenin蛋白及細胞增殖抗原PCNA的表達，進而誘導腫瘤細胞發生凋亡[27]。吳茱萸堿可通過降低缺氧誘導因子HIF-1α的及Akt1/2的蛋白水平，抑制PI3K/Akt的信號傳導，進而抑制人結腸癌LOVO細胞的增殖和轉移[28]；此外，趙[29]等人探索吳茱萸堿對人結腸癌細胞HCT-116增殖和遷移的影響，檢測到隨著時間和藥物濃度的增加，吳茱萸堿通過下調CyclinA1的表達，激活P53信號通路和Caspase-3促進細胞發生凋亡，且抑制細胞內的磷酸葡萄糖異構酶（Glucose Phospho Isomerase，PGI）介導的JAK2/STAT3信號通路的激活，降低MMP-3的表達實現細胞遷移抑制作用。由此可見，吳茱萸堿在抗結直腸癌中主要表現為誘導細胞發生凋亡，抑制腫瘤細胞遷移等作用。研究表明小檗堿能促進腸癌細胞HCT116及SW480中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的表達，通過靶向激活MAPK信號通路從而抑制了AOM/DSS誘導形成的腸癌[30]。檢測異鼠李素對LOVO細胞的增殖凋亡影響，發現其可抑制EGFR磷酸化，提高BAX的表達水平，降低Bcl-2的表達水平進而實現誘導細胞凋亡[31]。結合以上文獻及預測結果分析，本研究認為左金丸主要活性成分在作用于結直腸癌中的靶點分別如下：槲皮素主要對應靶點有 P53、bcl-2、bax[32]等；異鼠李素主要對應靶點TNFR、EGFR等；吳茱萸堿主要主要對應靶點有HIF-1α、PI3K、AKT、P53及Bax[33]、NF-κB及VEGFA[34]等；β淄谷醇主要對應到靶點β-catenin等；小檗堿對應的靶點有HSP90、p53、Fas等；異鼠李素對應的靶點有EGFR、BAX、Bcl-2等。

3 討論

結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，病變部位主要侵及結直腸。據2018年國家癌癥數據中心統計報告顯示：結直腸癌男性發病率位居第四，女性第三，死亡率均占第四。

左金丸中活性成分槲皮素、吳茱萸堿及小檗堿在結直腸癌的治療研究中報道相對較多，藥理學研究顯示槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集及抗炎的作用[35]，可通過P53等信號通路抑制腫瘤細胞增生，進而誘導細胞發生凋亡。研究表明吳茱萸堿除了抗炎鎮痛，抗病原微生物的作用外，還能增強機體的抗缺氧能力[36]，在結直腸癌的治療機制研究中主要涉及抑制細胞的增殖和周期、促進凋亡及自噬、抑制腫瘤血管新生等方面，其涉及的相關通路主要有PI3K-AKT、JAKSTAT等[37]。小檗堿具有抗炎、殺菌作用，另外研究也表明其也具有抗腫瘤、降血糖等作用，在結直腸癌中的研究主要涉及抑制腫瘤細胞增生、誘導細胞凋亡等方面[38]。

據已有文獻報道顯示：在實體瘤中，慢性缺氧環境能促進腫瘤細胞的增殖遷移及侵襲能力，而細胞上皮間質化是細胞喪失上皮表型轉為間質化細胞進而產生腫瘤原位浸潤及遠處轉移的重要因素之一。缺氧環境下，胞內的HIF-1α表達升高，而與上皮間質轉化相關蛋白鈣黏附蛋白表達下調，PI3K/Akt信號通路下游信號分子AKT1及ATM激酶磷酸化水平上調，HIF-1的主要靶基因是血管內皮生長因子（VEGF），它在腫瘤細胞中參與腫瘤細胞的新生，能使細胞耐受缺氧環境，促進腫瘤生長，因此HIF-1通路的活化是結直腸癌發生的一個重要機制之一[39]。研究表明炎癥在結直腸癌的發病中是一個至關重要的因素，慢性腸道炎癥對腸道持續性的刺激會使腸道上皮細胞持續性活化，進而使得細胞或血管異常增生。研究發現結直腸癌中有過度活化的STAT3異常表達，其可誘導SOCS3基因甲基化，進而導致STAT3通路失衡、持續活化。STAT3是IL-6的活化因子，而IL-6與結直腸的發病密切相關，STAT3在結直腸癌的發生中起著不可忽視的作用[40]。P53是抑癌基因，其突變是腫瘤發生的一個關鍵因素，在P53和結直腸癌的相關的通路中多表現與促細胞凋亡相關[41]。由此可見，左金丸在治療結直腸癌中涉及到相關的靶點主要與促進細胞凋亡、抑制炎癥、抑制細胞和血管增生密切相關。

在本研究預測結果中顯示富集通路FoXO信號通路，目前在結直腸癌的研究中，尚未見到左金丸及其活性成分與FoXO通路直接相關的的研究報道。其轉錄因子FoxO1中的蘇氨酸、絲氨酸以及賴氨酸殘基的磷酸化修飾能使其穿梭于細胞核內外,最終導致FoxO1轉錄活性的改變，進而參與細胞的增殖、凋亡、分化和抵抗氧化應激等[42]，但其在結直腸癌的發展中起著何種作用仍需要實驗驗證。

4 結論

本研究通過分析得到左金丸核心成分36種，其排名靠前且與結直腸癌密切相關的有槲皮素、小檗堿、吳茱萸堿等；50個潛在功能靶點，主要功能靶點涉及PIK3CA、TP53、HIF-1α、STAT3等；283條GO生物功能及58條KEGG，其中與HIF-1、PI3K-AKT等信號通路密切相關。根據相關文獻及預測分析結合表明：左金丸作用于結直腸癌潛在的機制可概括為：①調節機體免疫耐受能力，增強宿主免疫抵抗，抑制炎癥對腸粘膜的持續性刺激，進而阻止了細胞的異常增生；②通過上調抑癌基因，下調癌癥相關因子，促進腫瘤細胞發生凋亡；③降低腫瘤細胞的耐受缺氧環境，促進細胞細胞發生凋亡及上皮間質的轉移。

網絡藥理學的研究方法為中藥方劑效應機制的研究提供了新的研究方法，也為中醫經典名方的實驗研究及臨床應用提供了進一步的理論依據和研究思路。但是，由于研究依托公共數據平臺，難以獲得完整、準確和及時的數據，且缺乏網絡藥理的量化分析技術，這些是目前網絡藥理學研究的局限。其次，中醫在臨床上講究辨證論治，處方更是需要辯證施治，本研究尚未對復方配伍中的劑量關系層次進行探討。因此，網絡藥理學的預測結果有待進一步驗證。