知母不同藥用部位體外抗腫瘤、抗炎及抗氧化的作用研究＊

張亞楠，王 帥,2,3，包永睿,2,3，李天嬌,2,3,劉金瑛，孟憲生,2,3＊＊

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室 大連 116600；4.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京 100000）

知母為百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）的干燥根莖，也稱之為毛知母，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘、苦，性寒，入肺、胃、腎經(jīng)，是最常用的清熱瀉火類中藥之一[1-3]。具有清熱瀉火、滋陰潤(rùn)燥、止渴除煩、利大小便等功效[4-6]。《本草綱目》：知母（根）苦、寒，初步確定其藥用部位。知母作為中醫(yī)傳統(tǒng)藥物，以地下部位根入藥，廣泛用于治療多種疾病，如溫?zé)岵　⒏邿釤┛省⒖人詺獯⒈忝亍⑻摕┎幻摺⑾柿軡岬劝Y。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)知母含有多種化學(xué)成分，主要含有皂苷類、黃酮類、多糖類、有機(jī)酸類等，具有抗菌抗炎[7,8]、抗氧化[9]、抗病毒、抗腫瘤[10,11]等多種藥理作用，是現(xiàn)代醫(yī)藥研究中的熱點(diǎn)藥物之一。知母目前主要以其地下部位根入藥，而產(chǎn)量較高的地上部位被廢棄。但有關(guān)知母地上部分是否也具有較好藥理活性的研究鮮有報(bào)道。因此，為了進(jìn)一步挖掘知母的藥用潛能，更好利用民間的傳統(tǒng)藥物資源，以減少資源的浪費(fèi)，本研究以知母不同藥用部位為研究對(duì)象，基于體外藥用活性篩選和細(xì)胞模型，從其主要活性（抗腫瘤、抗氧化、抗炎）出發(fā)。探討并比較知母不同藥用部位活性差異，為知母作為一味傳統(tǒng)的中藥在現(xiàn)代醫(yī)藥方面的進(jìn)一步應(yīng)用和開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent1100型快速高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；TTE20140709倒置相差顯微鏡（德國(guó)麥克奧迪公司）；SpectraMaxPlus384酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Drvices公司）。

1.2 材料與試劑

人胃癌HGC-27細(xì)胞株、人肝腫瘤HEPG-2細(xì)胞株、人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株（購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)）；知母植物全株（采自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)本草園），經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為知母Anemarrhena asphodeloides Bge.；胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗、MTT（美國(guó)GIBCO公司）；LPS（北京索萊寶生物科技有限公司）；Griess試劑（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；二苯基苦酰肼基（DPPH）、2，2′-連氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽（ABST）、Vc（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)人胃癌HGC-27細(xì)胞株、人肝腫瘤HEPG-2細(xì)胞株、人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株（培養(yǎng)條件37℃，5%CO2），取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 供試品溶液的制備

將知母根、莖、葉、花各藥材粉碎過(guò)4號(hào)篩（65目）備用，分別稱取藥材粉末5 g，置于圓底燒瓶中，以15倍量50%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，合并濾液濾過(guò)，將濾液濃縮揮干去除溶劑，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用不同培養(yǎng)液分別定容至5 mL（生藥量0.1 g·mL-1），供體外細(xì)胞藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)用。按以上提取法制得知母根、莖、葉、花提取液，揮至5 mL（生藥量0.1g·mL-1）過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供HPLC檢測(cè)用。

1.5 知母不同不同藥用部位HPLC指紋圖譜的建立

取1.4項(xiàng)下供試品溶液，按以下HPLC色譜條件：Agilent TC-C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0-55 min，5%-22%B；55-60 min，22%-100%B；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 mL；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：256 nm，進(jìn)行分析檢測(cè)，得到知母藥材不同藥用部位的指紋圖譜。

1.6 體外抗腫瘤藥效學(xué)評(píng)價(jià)

采用MTT法，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌HGC-27細(xì)胞、人肝腫瘤HEPG-2細(xì)胞、人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液稀釋為5×10-4個(gè)·mL-1，以每孔100 μL的量分別接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為80%左右棄掉上清液，分別給與0.1g·mL-1（生藥）的知母根、莖、葉、花藥液刺激人胃癌HGC-27細(xì)胞、人肝腫瘤HEPG-2細(xì)胞、人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞24 h后，棄去上清液，每孔加入180 μL含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液，再避光加入20 μL的MTT溶液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中4 h。4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值A(chǔ)，計(jì)算細(xì)胞的增值抑制率[12]。

1.7 體外抗炎活性評(píng)價(jià)

1.7.1 LPS刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥細(xì)胞模型的建立

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞RAW264.7，用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋為5×10-4個(gè)·mL-1，以每孔100 μL的量分別接種于96孔板中置于5%CO2，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為80%左右棄掉上清液，加入含2 μg·ml-1LPS的1640培養(yǎng)液100 μl·孔-1，LPS刺激終濃度為1 μg·mL-1，刺激24 h。

1.7.2 MTT法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞的增殖活性

常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞RAW264.7，用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋為5×10-4個(gè)·mL-1，以每孔100 μL的量分別接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為80%左右棄掉上清液，設(shè)置空白組與給藥組。空白組：每孔加入100 μL 1640培養(yǎng)液；給藥組：每孔加入100 μL不同濃度的知母根、莖、葉、花含藥培養(yǎng)液（給藥組濃度分別為：0.05、0.025、0.0125 g·mL-1生藥量），設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，每孔加入180 μL含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液，再避光加入20 μL的MTT溶液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中4 h。4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值A(chǔ)，計(jì)算細(xì)胞的增值率[（A加藥組-A對(duì)照組）/A對(duì)照組×100%]。

圖1 知母不同藥用部位HPLC指紋圖譜

表1 知母不同藥用部位指紋圖譜相似度結(jié)果

1.7.3 Griess法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的水平

根據(jù)“1.7.1”所述建立的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型，分別設(shè)置空白組、模型組、給藥組。空白組：每孔加100 μL 1640培養(yǎng)液；模型組：每孔加100 μL濃度為1 μg·mL-1LPS；給藥組：每孔加入100 μL不同濃度的知母根、莖、葉、花含藥培養(yǎng)液（給藥組濃度分別為：0.05、0.025、0.0125 g·mL-1生藥量），設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，在37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取細(xì)胞上清液3000 r·min-1離心20 min。取上清100 μL按NO檢測(cè)試劑盒流程操作，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處的OD值，計(jì)算各組RAW264.7細(xì)胞分泌NO的含量。

1.8 體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.8.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13,14]，以常用抗氧化劑Vc為陽(yáng)性對(duì)照組，在96孔板中分別加入不同濃度的知母根、莖、葉、花無(wú)水乙醇稀釋液（給藥組濃度分別為：5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 mg·mL-1；陽(yáng)性藥Vc濃度：0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mg·mL-1）和100 μL DPPH（2 × 10-4 mol·L-1）自由基工作液，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入酶標(biāo)儀中振蕩1 min后室溫、避光靜置30 min,在517 nm處測(cè)定吸光度A，計(jì)算各組自由基清除率，并計(jì)算IC50值。

Asample為供試品與DPPH反應(yīng)后的吸光值；Ablank為供試品中未加DPPH反應(yīng)液時(shí)的吸光值；Acontrol為溶劑與DPPH反應(yīng)后的吸光值。

1.8.2 ABST自由基清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15,16]，將ABTS與K2S2O8分別配制成濃度為 7 mmol·L-1和 2.45 mmol·L-1的水溶液，并將兩種溶液混合，室溫避光放置12 h以上，得到ABTS儲(chǔ)備液。使用時(shí)用PBS稀釋使其在734 nm處的吸光度為0.78-0.82，-20℃保存待用。在96孔板中分別加入20 μL不同濃度的知母根、莖、葉、花無(wú)水乙醇稀釋液（給藥組濃度分別為：0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mg·mL-1；陽(yáng)性藥Vc濃度：0.050、0.075、0.100、0.150、0.200 mg·mL-1）和180 μL ABTS工作液，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。振蕩混勻，室溫條件下避光靜置6 min后測(cè)定溶液在734 nm處的吸光值。計(jì)算各組的自由基清除率，并計(jì)算IC50值（ABTS自由基清除率的計(jì)算公式與DPPH法一致）。

2 結(jié)果

2.1 知母不同不同藥用部位HPLC指紋圖譜

經(jīng)過(guò)HPLC分析檢測(cè)，得到知母不同藥用部位的指紋圖譜如圖1所示，根據(jù)色譜峰峰面積進(jìn)行相似度分析，以S1批樣品作為參照，進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，以中位數(shù)法生成共有模式圖，各樣品圖譜（S1-S4）相對(duì)于對(duì)照?qǐng)D譜R的相似度結(jié)果（表1，2，3）。得到其結(jié)果（表1）。從圖1指紋圖譜中共有峰的峰面積及數(shù)量可以看出知母4個(gè)不同藥用部位根、莖、葉、花的化學(xué)成分具有一定的差異性。知母根、莖、花的色譜峰較為單一，其中以知母莖的色譜峰數(shù)量和面積最為單一，知母葉的色譜峰最為豐富。從表1相似度結(jié)果數(shù)據(jù)我們不難發(fā)現(xiàn)：知母不同藥用部位根（S1）、莖（S2）、葉（S3）、花（S4）各組分之間存在一定差異。其中與對(duì)照指紋圖譜R相比較分為兩類，其中S1、S3、S4為第一類，相似度均達(dá)到0.85以上；S2為第二類，相似度僅為0.15左右。

表2 知母不同藥用部位對(duì)腫瘤細(xì)胞增值抑制作用的影響

2.2 知母不同藥用部位體外抗腫瘤藥效研究結(jié)果

如表2所示，知母不同藥用部位作用于人胃癌HGC-27細(xì)胞株、人肝腫瘤HEPG-2細(xì)胞株、人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株24 h后呈現(xiàn)出不同程度的增值抑制作用。知母莖對(duì)人胃癌HGC-27細(xì)胞株、人肝腫瘤HEPG-2細(xì)胞株、人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株無(wú)抑制作用；知母根、葉、花對(duì)人胃癌HGC-27細(xì)胞株、人肝腫瘤HEPG-2細(xì)胞株、人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株具有不同程度的抑制作用。

2.3 知母不同藥用部位體外抗炎活性研究結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與空白組相比，知母不同藥用部位在所選定的濃度范圍內(nèi)（0.0125、0.0250、0.0500g·mL-1生藥量）對(duì)Raw 264.7細(xì)胞活力無(wú)顯著影響（表3），說(shuō)明藥物在選定的濃度范圍內(nèi)對(duì)Raw 264.7細(xì)胞無(wú)毒性作用。

由表3可知，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，與空白組相比，LPS組均能夠很強(qiáng)的刺激巨噬細(xì)胞Raw 264.7釋放NO，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示炎癥細(xì)胞模型建模成功；給與不同濃度的知母不同藥用部位治療24 h后，與LPS組相比，均能減少NO的釋放，并且呈劑量依賴性關(guān)系，知母莖對(duì)減少NO釋放的效果最為顯著。

表3 知母不同藥用部位提取物對(duì)Raw 264.7細(xì)胞活力的影響

表4 知母不同藥用部位提取物Raw 264.7細(xì)胞分泌NO的影響

2.4 知母不同藥用部位體外抗氧化活性研究結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，知母不同藥用部位均具有較強(qiáng)的清除DPPH與ABST的能力（表4），其中知母不同藥用部位中，知母花對(duì)DPPH和ABST的清除能力最強(qiáng)（DPPH：IC50=4.171 mg·mL-1；ABST：IC50=0.375 mg·mL-1）（P ＜ 0.05），其次分別為知母葉、莖、根。

表5 知母不同藥用部位體外抗氧化活性

3 討論

知母作為一味廣泛使用的傳統(tǒng)中藥，其在我國(guó)野生以及人工種植的面積廣泛，資源豐富[17]。知母以地下部位根入藥，而產(chǎn)量較高的地上部分被廢棄，造成知母資源的浪費(fèi)、品種單一的問(wèn)題[18]。為了加強(qiáng)中藥在臨床的治療效果，合理利用天然藥用資源，精準(zhǔn)用藥，對(duì)于藥物的不同藥用部位要針對(duì)不同的疾病合理用藥。本研究以知母根、莖、葉及花為研究對(duì)象，對(duì)其不同藥用部位HPLC指紋圖譜進(jìn)行初步研究，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，進(jìn)一步對(duì)知母不同藥用部位體外抗腫瘤、抗炎、抗氧化活性進(jìn)行研究。

中藥的化學(xué)成分復(fù)雜，而其復(fù)雜的化學(xué)成分同時(shí)造成了不同的藥效作用，不同的藥效與不同的化學(xué)成分是協(xié)同作用的關(guān)系[19]。本研究基于HPLC法對(duì)知母不同藥用部位指紋圖譜初步研究并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示知母根、莖、花的色譜峰較為單一，其中以知母莖的色譜峰數(shù)量和面積最為單一，知母葉的色譜峰最為豐富。同時(shí)知母不同藥用部位之間也存在一定的相似性，與對(duì)照指紋圖譜相比，知母根、葉、花為一類。知母莖為一類。綜上可知知母不同藥用部位根、莖、葉、花的化學(xué)成分具有一定的差異性。

本研究對(duì)知母不同藥用部位體外抗腫瘤、抗炎、抗氧化活性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示知母不同藥用部位對(duì)人胃癌HGC-27細(xì)胞株、人肝腫瘤HEPG-2細(xì)胞株、人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株24 h后呈現(xiàn)出不同程度的增值抑制作用，其中知母莖對(duì)三種腫瘤細(xì)胞無(wú)抑制作用；知母根、葉、花對(duì)三種腫瘤細(xì)胞具有不同程度的抑制作用。巨噬細(xì)胞在抗炎活性研究中及其重要，其主要作用在于刺激其分泌炎性介質(zhì)，而LPS是誘導(dǎo)炎癥因子分泌的最有效的刺激物，通過(guò)減少巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子是分析檢測(cè)藥物抗炎效果的一個(gè)重要途徑[20]，NO是刺激巨噬細(xì)胞分泌的一種重要的炎癥介質(zhì)[21]，炎癥因子的分泌與腫瘤、高血壓、高血脂等疾病具有重要的關(guān)聯(lián)[22]。本研究結(jié)果得到知母不同藥用部位對(duì)LPS誘導(dǎo)的Raw 264.7細(xì)胞釋放的炎癥因子NO均有明顯的抑制作用，說(shuō)明知母具有明顯的抗炎作用，其中知母莖抗炎活性最強(qiáng)，是潛在的最有效的抗炎活性部位，其余抗炎效果強(qiáng)弱依次為知母花、葉、根。

相關(guān)研究表明多種疾病與自由基密切相關(guān)，人體表現(xiàn)出的癌癥、炎癥等多種癥狀均與體內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生的自由基不平衡有關(guān)，如高脂血癥血管內(nèi)膜的損傷以及腦中生物分子的氧化損傷、腫瘤中DNA受到氧化損傷等多種疾病與自由基密切相關(guān)[23,24]，因此開(kāi)發(fā)具有抗氧化活性的天然植物具有重要意義。本研究結(jié)果顯示知母不同藥用部位均顯示出不同程度的抗氧化作用，其中知母花對(duì)DPPH和ABST的清除能力最強(qiáng)，其次分別為知母葉、莖、根，這為今后天然抗氧化劑的研發(fā)提供重要的應(yīng)用前景。

綜上所述，研究表明知母不同藥用部位化學(xué)成分有一定的差異性，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示知母不同藥用部位體外抗腫瘤、抗炎、抗氧化作用的強(qiáng)弱具有一定的差異性，為了更好的發(fā)揮藥效，在臨床上對(duì)于不同疾病的治療在用藥部位上應(yīng)該精準(zhǔn)選擇。因此，本研究結(jié)果對(duì)知母進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用以及其不同藥用部位資源的擴(kuò)展及其合理應(yīng)用具有重要的參考價(jià)值。