灰色關聯(lián)度法研究紅蓼抗腫瘤的藥用部位研究＊

張紫嫣，包永睿,2,3，王 帥,2,3，李天嬌,2,3，劉金瑛，孟憲生,2,3＊＊

（1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室 大連 116600；4.北京中醫(yī)藥大學 北京 100029）

紅蓼（Polygonum orientale L.）系蓼科（Polygonaceae）蓼屬（Polygonum）一年生草本植物，廣布于中國各地。紅蓼的全草稱為葒草，具有祛風除濕、清熱解毒的功效，臨床上用于風濕性關節(jié)炎，冠心病，心胃氣痛等癥[1-3]。2015版藥典中植物紅蓼用藥部位為其果實水紅花子。紅蓼的根莖稱為葒草根，具有清熱解毒，除濕通絡的功效，臨床上用于痢疾，水腫，風濕痹病，跌打損傷等癥[4]；紅蓼的花序稱為葒草花，具有行氣活血，消積，止痛的功效，臨床上用于頭痛，心胃氣痛，腹中痞積等癥[5]；紅蓼的果實稱為水紅花子，具有散血消癥，消積止痛的功效，臨床上用癥瘕痞塊，癭瘤腫痛，食積不消等癥，也可用于治療胃癌、腸癌、肝癌、胃痛和肝炎等，對糖尿病也有效[6-8]。紅蓼全草、根、莖、花和果實均可入藥[1,4]，研究紅蓼的精準藥用部位具有重要意義。

本研究采用HPLC法建立紅蓼不同藥用部位HPLC指紋圖譜，結(jié)合灰色關聯(lián)度分析研究紅蓼根、莖、葉、花和果中抗腫瘤發(fā)揮藥效的精準用藥部位[9,10]，為其新藥開發(fā)及臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

胎牛血清（北京全式金生物技術有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；二甲基亞砜（Sigma公司）；胰蛋白酶（美國GIBCO公司）；四甲基偶氮唑鹽（美國GIBCO公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；對照品花旗松素（成都曼思特生物科技有限公司，批號：A0082，供含量測定用）；槲皮素（中國藥品生物制品檢定所，批號：100081-200406，供含量測定用）；山萘酚（中國藥品生物制品檢定所，批號：0861-200002，供含量測定用）。

實驗用6批紅蓼于2018年7-10月采集自遼寧沈陽，所有樣品均為野生，由遼寧中醫(yī)藥大學中藥植物教研室許亮教授鑒定為紅蓼（Polygonum orientale L.），每批藥材由30株紅蓼組成，并按照不同藥用部位分為根（G）莖（J）葉（Y）花（H）果（Z）五個混合樣品，所有樣品于50℃條件下烘干至恒定質(zhì)量，粉碎過2號篩，充分混勻，放入自封袋避光保存。人肝癌細胞株（HepG2）購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

Aglient1290型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；HD2-BCN-1360B型生物潔凈工作臺（哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）；SUNRISE型酶標儀（瑞士TECAN公司）；-80℃超低溫冰箱（海爾公司）；NKSY系列恒溫水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）；US AUTOFLOW型CO2培養(yǎng)箱（德國NUAIRE公司）；AE31型倒置相差顯微鏡（Motic公司）；CP225D電子分析天平（德國Sarto-rius分析天平有限公司，十萬分之一）；Milli-q超純水處理裝置（美國Millipore公司）。

1.2 供試品溶液和對照品溶液的制備

取不同藥用部位紅蓼藥材，粉碎（過2號篩），稱定10.00 g，置250 mL錐形瓶中，精密加入50%乙醇150 mL，稱定質(zhì)量，回流提取2 h，冷卻至室溫并補足減失質(zhì)量，濾過，揮干，用色譜級甲醇配成0.1 g·mL-1（生藥量）藥液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

精密稱取花旗松素、槲皮素、山萘酚對照品適量，加色譜級甲醇制成質(zhì)量濃度為0.0050 g·L-1的對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.3 高效液相色譜條件

Aglient1290型高效液相色譜儀，Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm x 250 mm，5 mm)；流動相（A）0.2%磷酸水-（B）甲醇，洗脫梯度（0 min-25 min）30%-68%B；（25 min-50 min）68%-83%；流速1 mL·min-1；檢測波長310 nm；柱溫設定為30℃；進樣量2 μL。

1.4 不同藥用部位紅蓼指紋圖譜的建立

取同一批紅蓼藥材的同一藥用部位，以花旗松素色譜峰（S）為參照，考察方法的精密度、穩(wěn)定性、重復性RSD值均≤3%，符合指紋圖譜方法學考察相關規(guī)定。

取6批紅蓼藥材的不同藥用部位，按1.2項下方法制備供試品溶液，按1.3項下色譜條件記錄色譜圖，將其導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版），以S1樣品為參照圖譜，中位數(shù)法生成譜圖，選擇色譜分離度、對稱度較好，且能夠滿足定性、定量要求的色譜峰作為特征峰，Mark峰匹配法進行自動匹配，生成紅蓼藥材高效液相指紋圖譜25個特征峰[11-13]。

1.5 不同藥用部位紅蓼體外抗肝腫瘤藥效

取培養(yǎng)2-3天、處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的肝癌細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，接種于96孔培養(yǎng)板。取不同藥用部位紅蓼及含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液混合配制成生藥量1 mg·mL-1的含藥培養(yǎng)液鋪入孔板繼續(xù)培養(yǎng)。藥物作用24 h后，棄去含藥培養(yǎng)液，每孔避光加20 μL（5 mg·mL-1）MTT和180 μL培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去含藥培養(yǎng)液加入150 μL DMSO，用酶標儀在492 nm處掃描，測定吸光值（OD）[14,15]。根據(jù)公式

計算不同藥用部位紅蓼抑制率。

1.6 紅蓼體外抗肝腫瘤藥效與高效液相色譜灰色關聯(lián)度研究

應用灰色系統(tǒng)理論建模軟件（GTMS3.0）將不同藥用部位紅蓼高效液相指紋圖譜25個特征峰的峰面積與不同藥用部位紅蓼體外抗腫瘤的抑制率進行關聯(lián)度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法建立指紋圖譜

根據(jù)1.4項下建立不同藥用部位紅蓼藥材對照指紋圖譜，得到25個高效液相特征峰，并按保留時間進行對照品比對[15]。特征峰保留時間分別為[1]7.186、[2]12.915（花旗松素）、[3]13.682、[4]14.390、[5]16.943、[6]18.306、[7]19.692、[8]20.679、[9]21.557、[10]25.308（槲皮素）、[11]26.773、[12]29.427、[13]29.850、[14]30.673（山萘酚）、[15]31.673、[16]31.800、[17]34.355、[18]35.047、[19]36.184、[20]38.437、[21]39.812、[22]40.503、[23]41.306、[24]41.952、[25]43.397，相似度均 ＞ 0.9（圖1，2，表1）。

2.2 不同藥用部位紅蓼體外抗肝腫瘤藥效

根據(jù)1.5供試品溶液制備方法配制不同藥用部位紅蓼含藥培養(yǎng)液，對肝癌細胞進行干預，以抑制率為指標，考察藥物干預24 h不同藥用部位紅蓼對肝癌細胞的增殖抑制作用（表2）。

圖1 不同部位紅蓼藥材對照指紋圖譜

2.3 灰色關聯(lián)度結(jié)果

根據(jù)1.6并將不同藥用部位紅蓼高效液相指紋圖譜25個特征峰的峰面積與體外抗腫瘤抑制率的相關性按關聯(lián)系數(shù)排列，得出相關系數(shù)大于0.7的特征峰保留時間、化學成分及關聯(lián)系數(shù)結(jié)果（表3）。

3 討論

紅蓼具有抗腫瘤的作用，其全草、根、莖、花和果實均可入藥[1,4]，研究紅蓼的精準藥用部位具有重要意義。本實驗采集6批紅蓼全株植物，按照藥用部位每批分為根、莖、葉、花和果共30個樣品，用灰色關聯(lián)度法將不同部位紅蓼高效液相對照指紋圖譜與體外抗肝癌抑制率關聯(lián)，關聯(lián)系數(shù)大于0.7的特征峰根據(jù)對照品比對，10號和14號峰分別為槲皮素和山萘酚，均是具有報道的抗肝癌化學成分，明確了紅蓼抗肝癌的物質(zhì)基礎。其中槲皮素是自然界廣泛存在的多醇羥基黃酮類化合物，具有明確的抗肝癌作用，機制可能與p53/miR-34a/SIRT1通路有關，近年來受學者廣泛關注[16]；山萘酚是一種多酚類抗氧化物，為天然黃酮類化合物的一種，已有文獻表明隨著山萘酚濃度增加和孵育時間延長導致肝癌細胞HepG2中凋亡因子Cleavedcaspase3的表達逐步增強，促使肝癌細胞HepG2凋亡[17]；根據(jù)本實驗室前期基礎，水紅花子中黃酮類成分可對肝癌SMMC-7721細胞具有明顯的抑制作用，且抑制作用和時間劑量成線性關系，其作用機制為抑制腫瘤細胞的增殖和誘導該細胞的凋亡[3,11]，皆可說明槲皮素和山萘酚均與肝癌的發(fā)生發(fā)展有相關性，該實驗證明槲皮素和山萘酚是紅蓼抗肝癌的主要物質(zhì)基礎。

圖2 紅蓼對照品比對圖譜

表1 不同部位紅蓼藥材對照指紋圖譜相似度評價

根據(jù)圖2不同部位紅蓼藥材高效液相對照指紋圖譜和表1不同部位紅蓼藥材對照指紋圖譜相似度評價可看出根莖成分相似，但根莖，葉，花和果之間差距較大；根據(jù)表2不同藥用部位紅蓼對肝癌的抑制率考察結(jié)果，可看出紅蓼抗肝癌藥效的相似；實驗結(jié)果表明，紅蓼根莖葉花果成分差異較大，但藥效結(jié)果相似，對藥效貢獻較大的色譜峰為紅蓼不同藥效部位的共有峰高度相似，這提示共有峰為紅蓼抗肝癌的作用的物質(zhì)基礎，其非公有峰有可能為紅蓼發(fā)揮其他藥理作用的物質(zhì)基礎，為今后精準治療提供實驗依據(jù)。

表2 不同藥用部位紅蓼對肝癌的抑制作用結(jié)果s,n=5

表2 不同藥用部位紅蓼對肝癌的抑制作用結(jié)果s,n=5

注：與空白組比較*P＜0.05。

1 2 3 4 5 6空白0.658±0.036-平均抑制率/%-根（G）32.23莖（J）34.55 38.48葉（Y）花（H）44.39果（Z）OD值抑制率OD值抑制率OD值抑制率OD值抑制率OD值抑制率OD值抑制率0.442±0.023*32.86%0.427±0.034*35.13%0.407±0.047*38.13%0.368±0.039*44.10%0.382±0.033*41.99%0.437±0.065*33.69%0.432±0.066*34.37%0.395±0.057*39.97%0.353±0.054*46.45%0.397±0.062*39.70%0.459±0.046*30.33%0.433±0.021*34.23%0.406±0.051*38.37%0.369±0.061*44.00%0.376±0.029*42.92%0.442±0.033*32.80%0.436±0.039*33.79%0.415±0.045*37.02%0.357±0.062*45.77%0.391±0.044*40.57%0.445±0.057*32.45%0.431±0.069*34.59%0.399±0.022*39.39%0.386±0.032*41.44%0.375±0.047*42.99%0.453±0.045*31.22%0.427±0.044*35.17%0.408±0.048*38.00%0.365±0.022*44.57%0.372±0.036*43.42%42.27

表3 關聯(lián)度計算結(jié)果及關鍵峰峰號

紅蓼全國分布廣泛，廉價易得，其中的山萘酚和槲皮素對肝癌藥效顯著，如作為精準治療肝癌藥物投入生產(chǎn)，將對治療癌癥做出巨大貢獻。同時該研究可以為其他中藥精準治療及明確物質(zhì)基礎提供方法和借鑒。