中藥小薊不同藥用部位體外抗炎、促凝血的作用研究＊

王鶴辰，包永睿,2,3，王 帥,2,3，李天嬌,2,3，劉金瑛,2,3，孟憲生,2,3＊＊

（1.遼寧中醫藥大學藥學院 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心 大連 116600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室 大連 116600）

小薊（Cirsium setosum(Willd.)MB.）俗稱“刺兒菜”，《中國藥典》記載，小薊“涼血止血，祛瘀消腫。”用于衄血，吐血，尿血，便血，崩漏下血，外傷出血，癰腫瘡毒[1]。關于小薊的藥用部位的功效，在不同的典籍中有不同的描述。如《本草圖經》中記載：“小薊生搗根絞汁服，以止吐血，衄血、下血。”《圣濟總錄》中記載小薊治療妊娠墮胎后出血不止：“小薊根葉（銼碎）、益母草（去根，切碎）各五兩。以水三大碗，煮二味爛熟去滓至一大碗，將藥于銅器中煎至一盞，分作二服，日內服盡。[2-3]”等。小薊用藥的現代研究表明，小薊有止血、收縮血管、抗菌、抗炎、抗癌等作用[4,5]。然而在目前的中藥開發理論指導下的小薊藥效研究，大都集中在一種或幾種活性物質的量的變化與藥效的關系上[6-9]，對不同的用藥部位的研究卻鮮見報道。本實驗旨在研究小薊根莖葉花在成分與抗炎，止血藥效方面的區別。

本實驗采用對照品比對鑒定色譜峰的種類，以不同藥用部位的指紋圖譜作為物質基礎，比較小薊不同藥用部位提取物的抗炎與促凝血藥效的區別，使用灰色關聯計算軟件計算出檢定出的每種成分對抗炎與凝血酶原指標的貢獻程度，嘗試篩選出治療一種病癥的最優藥用部位，建立了多種化合物與藥效的聯系[10]。提出了一個精準的分析方法，為傳統中藥小薊的合理使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

NUAIRETM US AUTOFLOW型CO2培養箱（德國NUAIRE公司）；Agilent 1290型快速高效液相色譜儀（安捷倫公司）。

1.2 試劑與藥材

KM小鼠（遼寧長生生物有限公司，許可證號：SCXK（遼）2018-0301），乙腈（色譜純，德國Merck公司）；冰乙酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；小鼠凝血酶原(PT)酶聯免疫試劑盒；小薊藥材（購自山東，經遼寧中醫藥大學中藥鑒定教研室許亮教授鑒定為菊科植物小薊（Cirsium setosum(Willd.)MB.）的干燥全株）。

1.3 供試品溶液的制備

將小薊藥材按根、莖、葉、花分開，粉碎，過3號篩，各取粉末約5.0 g，置于圓底燒瓶中，精密加入200 mL的95%乙醇溶液，加熱回流提取1 h，放冷，濾過，取續濾液搖勻過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.4 小薊不同藥用部位指紋圖譜的建立

1.4.1 色譜條件

色譜柱Agilent poroshell SB-C18（4.6 mm×100 mm,2.7 μm），流動相乙腈（B）-0.5%冰乙酸（A），梯度洗脫，0-6min 5.0%-13%B，6-20 min 13%B，20-60 min 13%-22%B，60-90 min 22.0%-100.0%B，柱溫30℃，檢測波長：260 n，供試品進樣量10 μL。

1.4.2 HPLC指紋圖譜的建立

取1.3項供試品溶液按2.2.1項色譜條件，進行分析檢測，得到小薊藥材不同入藥部位的液相圖譜。將圖譜信息導入中藥指紋圖譜相似度評價軟件（2012版），得到小薊不同用藥部位的指紋圖譜。

1.5 對照品比對鑒定色譜峰成分

經前期文獻調研，明確了多種在小薊藥材中可能存在的與抗炎、促凝血相關的活性成分[11,12]。經過比對保留時間，最終確定了11種存在于小薊藥材中的成分。

1.6 小薊不同部位提取物在抗炎，止血方面的藥效學評價

1.6.1 小薊不同部位提取物對小鼠炎癥RAW264.7細胞的抑制作用

RAW264.7小鼠單核巨噬細胞，常規培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，取對數生長期的細胞接種于96孔板中，取4種供試品溶液各2.5 mL，濾過，揮干后分別溶于10 mL培養液中（經計算，濃度為每毫升培養液中含0.062 5 g生藥提取物）。待細胞貼壁后，將孔內空白培養液替換為加藥培養液作用24 h（每組十個復孔）。使用MTT法染色，使用酶標儀檢測活細胞數量，計算方法如下。

1.6.2 小薊不同部位提取物對小鼠血漿中凝血酶原指標的影響

將60只KM小鼠（雄性，20-22 g）按根，莖，葉，花，西陽，空白平均分成6組，每組10只，西陽藥物選用維生素K3。每次按0.025 g生藥量/只給藥，西陽按每次0.0125 g·只-1給藥，空白組給予相同體積生理鹽水。連續灌胃7天，以肝素鈉為抗凝劑取血漿，按試劑盒說明書操作，每組取5個復孔。使用酶標儀進行檢測，將每個復孔的數據進行整理，根據試劑盒的原理，酶標儀的示數越大，產生的指標物質越多，說明藥效越好。

1.7 灰色關聯度分析

分別將小薊四個不同部位提取物對RAW細胞的抑制率、四個不同部位提取物對小鼠凝血酶原的指標數值作為母序列，圖譜中11種成分的峰面積作為子序列，采用灰色關聯度分析軟件(GreyModeling V3.0)進行分析。得出小薊不同藥用部位色譜峰與其對RAW細胞的抑制率與小鼠凝血酶原指標的關聯系數（貢獻程度）。

2 結果

小薊不同用藥部位化合物保留時間與峰面積信息（表1），指紋圖譜信息（圖1）。

體外實驗結果顯示，小薊花的藥效最強對RAW264.7細胞的抑制率最大，根次之，莖與葉對RAW264.7細胞的抑制率作用不大（圖2）。試劑盒的結果數據顯示，小薊花對小鼠凝血酶原指標影響最大，葉次之，莖與根對指標影響較小（圖3）。

使用GreyModeling V3.0軟件，計算出小薊不同藥用部位的色譜峰面積與RAW細胞的抑制率以及小鼠凝血酶原指標的關聯系數信息（圖4）。結果顯示，綠原酸、橙皮苷、咖啡酸、蒙花苷對抑制炎癥細胞增值（抗炎）與升高凝血酶原指標（止血）的關聯系數與其他成分相比較高，說明這四種成分對抗炎與止血的貢獻程度較大。

圖1 小薊不同部位指紋圖譜與共有峰

表1 小薊藥材中不同部位的化學成分

3 討論

中藥的藥用部位在典籍中有很多記載，其中針對不同的病癥，往往施用不同的藥用部位。這提示現代的研究者，應該開展針對不同部位的相關研究。中藥的現代研究表明，中藥的藥效與中藥的物質基礎緊密相關，通過對藥效物質基礎的研究可以對中藥的傳統理論賦予現代的科學解釋[13]。中藥中成分組成復雜多樣，只通過測定其中一種或幾種成分的含量通常無法全面地說明中藥質量與療效的好壞[14]。所以，研究生藥不同采收時間、不同用藥部位化學成分差異與不同病癥療效之間的關系，明確生藥的精準應用意義重大。

圖2 小薊不同部位對RAW264.7細胞的體外抑制率

圖3 小薊不同部位的小鼠凝血酶原（PT）試劑盒結果（P＜0.05）

本實驗以傳統中藥小薊為研究對象，建立了不同藥用部位的指紋圖譜，針對外抗炎藥效與凝血酶原（PT）指標，研究了小薊不同部位的精準使用。結果顯示，不同的部位成分種類與含量差異較大，從指紋圖譜中峰面積及數量可以看出，小薊全株中4個部位的化學成分具有一定的差異性。小薊花中成分種類最多，根中成分種類最少，而莖與葉中成分種類基本一致，含量有所區別。

圖4 GreyModeling V3.0軟件計算出小薊中11種成分對抗炎，凝血的貢獻程度（P＜0.05）

小薊可清熱消腫，在前期的相關研究中，我們發現小薊黃酮中的一些成分可以對癌細胞有較好的抑制作用[15]，而炎癥與癌癥的產生往往存在先后順序[16]。這也提示我們，研究小薊提取物的抗炎作用有很大的意義。古籍中記載小薊能“涼血止血”，在歷史上小薊也多用于治療血流不止。而止血與現代醫學凝血的概念類似，現代醫學認為凝血其基本過程是一系列蛋白質的有限水解過程，大體上分為三個階段，凝血酶原激活物形成、凝血酶形成、纖維蛋白形成，其中凝血酶原的形成是整個凝血過程的重要一步（在體內需要維生素K參與）。

本實驗選取凝血酶原作為檢測指標，以維生素K3作為西陽對照組，小薊不同部位提取物對指標的影響也就反映了其對促進凝血的效果，數值越大，產生的促凝血指標物質的量與陽性藥維生素K3越接近。體外藥效結果顯示，小薊花的抗炎效果最好，小薊根也有一定的效果。而凝血酶原（PT）試劑盒的結果表明，小薊花的促凝血效果最好，除西陽組外，產生的指標物質最多，小薊葉也有一定的效果。試劑盒與體外實驗結果說明，小薊不同部位化學成分種類與含量的差異是導致藥效有區別的原因。灰色關聯度計算軟件的結果顯示，綠原酸、橙皮苷、咖啡酸、蒙花苷等成分對小薊提取物的體外抗炎效果與影響凝血酶原指標的產生貢獻程度與其他成分相比較大并存在差異。植物化學研究表明，小薊主要含有黃酮類、酚酸類以及甾醇類化合物。其中，黃酮類成分是影響其藥理學活性的主要因素。現代藥理學和臨床研究表明小薊中的一些成分具有止血、抗炎、抗腫瘤、抗微生物等作用。其中綠原酸、咖啡酸可以通過影響NF-κB信號通路，減少炎癥介質的釋放。蒙花苷能緩解血管內皮細胞炎癥損傷，橙皮苷通過降低毛細管脆性，有保護毛細血管的作用[17-20]。本實驗的灰色關聯數據結果也佐證了小薊黃酮類物質的現代藥理學研究。

中藥的現代化已經實踐多年，成果顯著。隨著分析與檢測手段的不斷進步，對于傳統理論的科學解釋也越來越豐富[21-23]。研究中藥不同部位的使用，為中藥的現代化打開了一個新的思路。本實驗為小薊藥材不同藥用部位的合理使用提供了一個科學的依據及分析方法，也為提高小薊藥材的治療效果提供了一個理論支持。