中藥仙鶴草不同藥用部位的體外藥效學研究＊

田露露，包永睿，王 帥，李天嬌，劉金瑛，孟憲生

（1.遼寧中醫藥大學藥學院 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心 大連 116600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室 大連 116600；4.北京中醫藥大學 北京 100029）

仙鶴草為薔薇科植物龍芽草Agrimonia pilosa Ledeb.的干燥地上部分，味苦、澀，性平，歸肺、肝、脾經，有軟堅散結、收斂止血、益氣扶正的功效[1-3]。其藥用部位演變過程為“根、根芽、全草、地上部分”，《別錄》曰：“八月采根，曝干。”《本草圖經》亦曰：“三月、八月采根，日干。”說明其用藥部位是根，而《蜀本草·圖經》則明確指出：“二月、三月采牙，日干”，說明仙鶴草的藥用部位已從根而逐步精確到了根芽。到晉、唐時期，龍牙草的藥用部位已從根芽擴大到全草，如《范汪方》用狼牙草莖葉熟搗，敷貼之，治金瘡，兼能止血，古人充分認識到了仙鶴草各個部位的作用，擇而用之，2015版藥典載仙鶴草藥用部位為干燥地上部分[1,4]。近年來，雖然關于仙鶴草抗腫瘤、抗氧化、抗凝血等活性的研究得到重視，但其不同部位的精準應用實驗研究報道較少[5]。故本實驗建立仙鶴草不同藥用部位的指紋圖譜并進行相似度評價，同時比較研究仙鶴草不同藥用部位抗腫瘤、抗氧化、抗凝血作用，以期為仙鶴草藥材不同藥用部位的合理使用提供科學依據，為生藥不同部位的精準應用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞株HepG2細胞、人胃癌細胞株HGC-27細胞、人結腸癌細胞株Caco-2細胞均由中國科學院上海生命科學研究院細胞庫提供；昆明種小鼠購自遼寧長生生物技術有限公司（合格證號：SYXK（遼）2013-0009）；仙鶴草藥材（采自遼寧中醫藥大學百草園）遼寧中醫藥大學許亮教授鑒定為Agrimoniapilosa Ledeb.的干燥全草；2，2'-聯氮-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）均購自上海阿拉丁試劑有限公司；小鼠凝血酶原（PT）酶聯免疫試劑盒購自上海朗頓生物技術有限公司；DMEM培養基、雙抗、胎牛血清、胰酶、MTT購自美國Gibco公司。

1.2 儀器與設備

Agilent1100型快速高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；SpectraMaxPlus384光吸收酶標儀（美國MolecularDrvices公司）。

1.3 供試品溶液的制備及藥液的配制

分別取仙鶴草根、莖、葉、花粉末（過3號篩）約5.0 g，置于圓底燒瓶中，加入75 mL50%的乙醇溶液，加熱回流提取1 h，濾過，回收溶劑至干，供體外抗腫瘤、抗氧化、促凝血作用實驗用，根、莖、葉、花的得率分別為11.0%、13.8%、27.6%、24.8%；同法制得仙鶴草根、莖、葉、花提取液，濾過，取續濾液搖勻過0.22 μm微孔濾膜，供HPLC分析實驗用。

1.4 HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價

取2.1項供試品溶液，AgilentTC-C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：0.3%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），程序梯度洗脫0-35 min，5%-18%B；35-40 min，18%-18%B；40-55 min，18%-26%B；55-75 min，26%-40%B；75-80 min，40%-100%B，流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；進樣量10 μL；檢測波長320 nm。分析檢測，得到仙鶴草藥材不同藥用部位的指紋圖譜。應用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》（國家藥典委員會）軟件，將實驗結果導入軟件生成對照圖譜，進行相似度評價。

1.5 體外抗腫瘤藥效評價

人肝癌細胞株HepG2細胞、人胃癌細胞株HGC-27細胞、人結腸癌細胞株Caco-2細胞均培養于含體積分數為10%胎牛血清的DMEM培養液中，取對數生長期的細胞接種于96孔培養板，繼續培養24 h后，棄上清液，分別用0.1 g·mL-1、0.75 g·mL-1、0.50 g·mL-1、0.25 g·mL-1、0.10 g·mL-1（生藥）的仙鶴草根、莖、葉、花含藥培養液（0.1%DMSO助溶）刺激HepG2細胞、HGC-27細胞、Caco-2細胞24 h后，每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，4 h后棄上清液，加入150 μLDMSO，震蕩溶解紫色結晶，酶標儀492 nm波長下測定吸光度（OD），計算細胞增值抑制率，并使用SPSS 17.0計算半數有效濃度（IC50）[6]。

1.6 體外抗氧化活性評價

1.6.1 DPPH法

參照文獻[7]，以Vc為陽性對照，在96孔板中分別加入100 μL 20.0 mg·mL-1、15.0 mg·mL-1、10.0 mg·mL-1、7.5 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1（生藥）的供試品溶液和100 μL DPPH（2×10-4mol·L-1）自由基工作液，振蕩均勻，室溫、避光靜置30 min，測定溶液在517 nm處的吸光值，每組平行設3個復孔。按如下公式計算供試品的自由基清除率，并計算出IC50值。

Asample為供試品與DPPH反應液作用后的吸光度；Acontrol為溶劑50%乙醇與DPPH反應液作用后的吸光度。

1.6.2 ABTS法

參照文獻[8]，精密稱取ABTS和K2S2O8適量，使用去離子水將其分別溶解并轉入容量瓶中混合，定容使其終濃度分別為7.00和2.45 mmol·L-1，在室溫、避光條件下反應12 h，得到ABTS儲液。用前以PBS（pH7.4）稀釋成在734 nm波長下吸光度為0.7±0.02的工作液。以Vc為陽性對照，在96孔板中分別加入2 μL 20 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.75 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1（生藥）的供試品溶液和180 μLABTS工作液，振蕩均勻，室溫、避光靜置6 min，測定溶液在734 nm處的吸光值，每組平行設3個復孔。計算供試品的自由基清除率，并計算出IC50，ABTS自由基清除率的計算公式與DPPH法一致。

1.7 對凝血酶原（PT）的影響

昆明種小鼠60只（雄性，20-22 g），隨機分為空白對照組，陽性組，仙鶴草根、莖、葉、花組，共6組，每組10只，置于通風條件下，自由飲水飲食。空白對照組灌胃給予生理鹽水0.1 mL·10 g-1，仙鶴草根、莖、葉、花組以0.01 g生藥·g-1灌胃，每日給藥1次，連續3天，眼球取血0.45 mL置于肝素鈉處理的離心管中，3000 r·min-1離心15 min，收集血漿。按試劑盒的要求進行凝血酶原（PT）的測定。

圖1 仙鶴草不同藥用部位指紋圖譜（S1根，S2莖，S3葉，S4花，R軟件生成對照指紋圖譜）

表1 指紋圖譜相似度結果

表2 仙鶴草不同用藥部位對癌細胞株增殖的影響（n=3）

2 實驗結果

2.1 仙鶴草藥材不同藥用部位指紋圖譜及相似度計算結果

仙鶴草不同藥用部位指紋圖譜與對照圖譜（圖1），相似度計算結果（表1）。從指紋圖譜峰面積及數量、相似度計算結果可以看出，仙鶴草不同藥用部位的化學成分存在較大差異。

2.2 仙鶴草藥材不同藥用部位體外抗腫瘤藥效結果

仙鶴草仙鶴草藥材不同藥用部位作用HepG2細胞、HGC-27細胞、Caco-2細胞24 h后，對細胞的增殖抑制作用結果（表1）。仙鶴草根、莖、葉、花對人肝癌細胞株HepG2細胞、人胃癌細胞株HGC-27細胞、人結腸癌細胞株Caco-2細胞有不同程度的增殖抑制作用，莖對三種癌細胞株的增殖抑制作用最強。

2.3 仙鶴草藥材不同藥用部位體外抗氧化活性結果

DPPH是屬于極少在室溫下穩定的自由基之一，DPPH有一個單電子，在517 nm有強的吸收。當自由基被清除時吸光度下降，同時顏色變淺黃。ABTS在適當的氧化劑作用下被氧化成墨綠色的ABTS+，當具有抗氧化活性的物質加入到預先形成的ABTS+溶液中后，在抗氧化物質的作用下ABTS+轉變成ABTS，這時溶液會發生褪色，在734 nm處的吸光度會下降，褪色程度取決于樣品的抗氧化活性和濃度，因此可以用于體外抗氧化活性的評價［9］。仙鶴草藥材不同藥用部位均顯示較強體外抗氧化活性，葉、花清除DPPH、ABTS自由基的能力強于根、莖，結果（表3）。

2.4 仙鶴草藥材不同藥用部位對凝血酶原影響的結果

與空白組比較，仙鶴草根、莖、葉組小鼠凝血酶原水平明顯降低（P＜0.01），提示仙鶴草藥材不同藥用部位均對降低凝血酶原水平有作用。其中，仙鶴草莖組和仙鶴草葉組效果更明顯。結果（圖2）。

3 討論

《神農本草經百種錄》：“凡藥之用……各以其所偏勝而即資之療疾，故能補偏救弊，調和臟腑”，藥物的不同藥用部位偏勝不同，入藥也存在差異，縱觀歷代本草，對不同藥用部位性效的不同已有深入認識。《湯液本草》載：“凡根之在土者，中半以上，氣脈之上行也，以生苗者為根；中半以下，氣脈之下行也，入土以為梢。病在中焦與上焦者，用根；在下焦者，用梢。根升而梢降。大凡藥根有上中下：人身半以上，天之陽也，用頭；在中焦用身；在身半以下，地之陰也，用梢。述類象形者也。”《本草發揮》謂：“當知病在中焦用身，上焦用根，下焦用梢。”《本草蒙筌》稱：“根梢各治，尤勿混淆。生苗向上者為根，氣脈行上；入土垂下者為梢，氣脈下行。中截為身，氣脈中守。上焦病者用根，中焦病者用身，下焦病者用梢。蓋根升梢降，中守不移故也［10］”。仙鶴草，首載于《神農本草經》，即古時所稱的狼牙草，最早以根、根芽入藥，名牙子，狼牙，后擴展至以全草入藥，稱狼芽草，2015版藥典載仙鶴草藥用部位為干燥地上部分，隨著現代中藥研究的不斷深入，同一植物，不同的藥用部位，由于性狀特點不同或主要成分的積累分布差異，導致不同藥用部位藥理藥效有一定差異[11-13]。因此，為了更好地利用仙鶴草藥材的藥用價值，有效開發藥材資源，本實驗對仙鶴草不同藥用部位的指紋圖譜進行研究并進行相似度評價，各藥用部位指紋圖譜的差異直觀而明顯，根和莖的色譜峰較為單一，色譜峰的數量與強度都少于花和莖，花和莖色譜圖的指紋信息較為豐富，具有各自的特征性，又具備一定的相似性，提示仙鶴草不同藥用部位的化學成分具有一定的差異性。

化學成分的不同導致不同藥用部位藥理效應有一定差異[14]。本研究體外抗腫瘤實驗結果表明仙鶴草各藥用部位均顯示較強抗腫瘤、抗氧化藥效、抗凝血作用，其中莖抗人肝癌細胞株HepG2細胞、人胃癌細胞株HGC-27細胞、人結腸癌細胞株Caco-2細胞增殖的作用強于其根、葉、花三個部位，葉、花清除DPPH、ABTS自由基的作用強于根、莖兩個部位，莖、葉降低小鼠血漿凝血酶原水平作用強于根、花兩個部位，表明中藥藥用部位的不同，與用藥安全、療效關系緊密。隨著對仙鶴草的研究日益增多，抗腫瘤、抗氧化、鎮痛抗炎、止血降壓、抗瘧殺蟲等作用使其在臨床上被廣泛用于治療腫瘤、糖尿病、出血、梅尼埃病及陰道滴蟲病等病。同時因仙鶴草具有補虛扶正的藥效，使其單方或復方對治療內外婦兒科等疾病都有著較好的療效，值得臨床推廣。藥效的深入研究使得其安全有效性成為關鍵前提，然而，目前對仙鶴草的藥用部位精準應用研究分析不夠深入，今后宜開展仙鶴草系統規范的藥用部位研究，觀察其臨床療效，以期更好地指導臨床合理用藥［15］。

表3 仙鶴草不同用藥部位清除DPPH、ABTS自由基結果（n=3）

圖2 仙鶴草不同藥用部位對凝血酶原的影響（n=10，*與空白組比較P＜0.01）

隨著中藥現代研究的不斷深入，中藥藥用部位的療效與成分也需得到進一步研究。本實驗結果顯示仙鶴草藥材不同藥用部位的化學成分存在一定差異，同時抗腫瘤、抗氧化、抗凝血藥效實驗結果顯示治療不同病癥的最佳藥用部位也有所不相同，提示生藥治療不同疾病藥用部位不可一概而論，為仙鶴草藥材的合理使用提供科學依據，為生藥不同部位的精準應用奠定實驗基礎。