車前草不同藥用部位抗炎、抗腫瘤、抗氧化的活性研究＊

崔琳琳，包永睿,2,3，王 帥,2,3，李天嬌,2,3，劉金瑛，孟憲生,2,3＊＊

（1.遼寧中醫藥大學藥學院 遼寧 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心 遼寧 116600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室 遼寧 116600；4.北京中醫藥大學 北京 100029）

車前草，又名車輪草、豬耳草，屬車前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前 Plantago depressa Willd.的干燥全草[1,2]。始載于《神農本草經》，列為上品。性寒、味甘，歸肝、腎經，具有清熱、利尿通淋、涼血解毒、祛痰的功效，常用于治療癰腫瘡毒、水腫尿少、痰熱咳嗽等疾病[3-5]。研究發現，車前草中含有黃酮類、三萜類、多酚類、生物堿類等化學成分[6]。藥理活性方面，車前草除有利尿通淋、止瀉緩瀉作用外，在抗炎、抗腫瘤、抗氧化等方面顯示出潛在的藥用價值[7-9]。隨著近年車前草的價值被日益發掘，社會對其需求也越來越大。然而目前對于車前草的研究工作主要集中在資源調查、化學成分上，對藥效的研究主要集中在利尿，止瀉緩瀉上，對車前草不同用藥部位及其它藥效研究卻鮮有報道。本文旨在研究車前草不同藥用部位抗炎、抗腫瘤、抗氧化活性差異，進一步明確車前草不同藥用部位的合理使用，擴大車前草臨床用藥，更好地開發利用車前草資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（安捷倫公司）；HD2-BCN-1360B型生物潔凈工作臺（哈爾濱東聯電子技術開發有限公司）；SUNRISE酶標儀（瑞士TECAN公司）；超低溫冰箱-80℃（海爾公司）；NKSY系列智能恒溫水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）；USAUTOFLOW型CO2培養箱（德國NUAIRE公司）；AE31型倒置相差顯微鏡（Motic公司）。

1.2 試劑

胎牛血清（北京全式金生物技術有限公司）；DMEM高糖培養基（美國GIBCO公司）；二甲基亞砜（Sigma公司）；胰蛋白酶、MTT（美國GIBCO公司）；對氨基苯磺酸、抗壞血酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）；α-萘胺（國藥集團化學試劑有限公祠）；DPPH、ABTS（北京索萊寶科技有限公司）；蘆丁（批號：17120702）、毛蕊花糖苷（批號：16072904）、二氫槲皮素（批號：15060820）對照品均購自于成都普菲德生物技術有限公司，純度均≥98%；乙腈為色譜純（Merck公司）；水為超純水。

1.3 藥材

車前草藥材，取自遼寧中醫藥大學本草園，經遼寧中醫藥大學中藥鑒定學教研室許亮教授鑒定為車前科植物平車前（Plantago depressa Willd.）的干燥全草。將車前藥材分為車前根、車前葉、車前子及除去根、葉、子后的剩余部位，于陰涼處干燥。

1.4 細胞株

人肝癌細胞株HepG2、小鼠RAW264.7均購自齊氏（上海）生物科技有限公司。

1.5 指紋圖譜的建立

1.5.1 色譜條件

色譜柱：AgilentPoroshellSB-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm），填料：十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相：0.2%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0-10 min，5%→20%B，10-45 min，20%→38%B，45-50 min，38→100%B），流速0.8 mL·mm-1，柱溫為30℃，檢測波長260 nm。

1.5.2 供試品溶液的制備

準確稱取干燥后的車前不同部位藥材粗粉5.0 g置于150 mL具塞錐形瓶中，加入15倍量50%乙醇回流提取1 h，放冷，過濾。取續濾液1 mL，進樣前過0.22 μm微孔濾膜做供試品溶液，其余液體濃縮成浸膏，收集浸膏，計算出膏率（根：9.3%、葉：28.8%、子：34.5%剩余部位：12.9%）。

1.5.3 對照品溶液的制備

取蘆丁、毛蕊花糖苷、二氫槲皮素對照品適量，加甲醇制成每1 mL約含0.2 mg的混合對照品溶液，即得。

1.6 細胞培養

人肝癌細胞HepG2、小鼠RAW264.7巨噬細胞經解凍復蘇后，按本實驗室細胞培養SOP常規培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.7 體外藥效學評價

1.7.1 抗炎活性測定

參照文獻[10]方法，取培養2-3天、處于對數生長期、生長狀態良好的RAW264.7細胞，經1xPBS清洗兩次，每次3 mL，用刮刀刮取細胞，并用細胞培養液吹打混勻，于細胞計數板上計數，加培養液稀釋至濃度為5×104個·mL-1，接種于96孔板中，每孔100 μL，繼續培養12 h。精密稱取車前草不同藥用部位浸膏適量，加適量DMSO助溶，加培養液配制成不同濃度含藥培養液（給藥組濃度分別為0.04、0.06、0.08、0.1 g·mL-1生藥量），棄掉舊培養液，添加不同濃度含藥培養液，再添加100 μL LPS（終濃度為1μg·mL-1），混勻，繼續培養24 h；取出96孔板，每孔吸取100 μL上清液轉移至新96孔板中，加入等體積Griess試劑，反應10 min，酶標儀測定540 nm處吸光值。將舊96孔板中剩余培養液棄掉，每孔加100 μL MTT溶液（0.05μg·mL-1），置于37℃培養箱中培養1 h，小心吸去MTT溶液，每孔加入200 μL DMSO溶液，37℃恒溫搖床振蕩15 min，酶標儀測定550 nm處吸光值。以細胞活力＞50%，NO抑制率≥50%，作為樣品具有抗炎活性的篩選指標。

細胞活力（%）=樣品OD550/對照OD550×100

NO抑制率（%）=對照OD540-樣品OD540/對照OD540×100%

1.7.2 抗腫瘤活性測定

取培養2-3天、處于對數生長期、生長狀態良好的肝癌細胞HepG2，經1xPBS清洗兩次，每次3 mL，用1 mL胰蛋白酶（濃度為0.25%）消化，待細胞趨于變圓用培養液終止消化，并沖洗吹打細胞制成細胞懸液。于細胞計數板上計數，加培養液稀釋至濃度為5×104個·mL-1，接種于96孔培養板，每孔100 μL，繼續培養約12 h待細胞貼壁完全。精密稱取車前草不同藥用部位浸膏適量，加適量DMSO助溶，加培養液配制成不同濃度含藥培養液（給藥組濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g·mL-1生藥量）。設加藥試驗孔、空白對照孔（加細胞，但不加藥物），每組設5個復孔。繼續培養，藥物作用一定時間后，每孔避光加20 μL（5 mg·mL-1）MTT，繼續于37℃培養箱中培養4 h后吸凈孔內上清液，每孔加入150 μLDMSO，搖床振搖10 min，用酶標儀在492 nm處掃描，測定吸光值。

圖1 車前不同藥用部位指紋圖譜疊加圖

細胞抑制率=(1-A給藥組/A空白組)×100%

1.7.3 抗氧化活性測定

（1）DPPH自由基清除能力

配置濃度為0.5 mmol·L-1的DPPH工作液。精密稱取車前不同藥用部位浸膏適量，加95%乙醇配制成生藥濃度為10.0、8.0、6.0、4.0、2.0 mg·mL-1供試品溶液，取不同濃度供試品溶液和DPPH工作液各100 μL于96孔板中，每個濃度各取3個復孔，空白對照加95%乙醇。避光反應30 min后于酶標儀中選取517 nm波長測定吸光度A。以抗壞血酸作為陽性對照，清除率按如下公式計算：

清除率=(A0-A樣)/A0×100%。A0為空白溶液，A樣為樣品溶液。

（2）ABTS自由基清除能力

配置濃度為 7.4 mmol·L-1的ABTS和2.6 mmol·L-1的K2S2O8。取適量ABTS和K2S2O8混勻，置于暗處室溫條件下靜置12-16 h得ABTS工作液。使用前用PBS稀釋至吸光度值為0.7±0.02。精密稱取車前不同藥用部位浸膏適量，加95%乙醇配制成生藥濃度為10.0、8.0、6.0、4.0、2.0 mg·mL-1供試品溶液。吸取ABTS工作液100 μL，供試品溶液50 μL，充分混勻，避光放置6 min，于734 nm波長下檢測吸光度A，空白加95%乙醇。以抗壞血酸作為陽性對照，按1.7.3.1項下公式計算清除率。

1.8 統計學處理

采用SPSS17.0軟件進行實驗數據的統計分析，所得各組數據均采用（s）表示。多組數據組間的比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 車前不同藥用部位指紋圖譜及共有峰的建立

取車前不同藥用部位樣品，按“2.1.2項”下方法制備各供試品溶液，按“2.1.1項”下色譜條件進樣，進行HPLC測定與分析，記錄色譜圖，應用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》（國家藥典委員會）軟件，將實驗結果導入軟件，設置S2為參照圖譜，系統生成對照圖譜R，進行相似度評價（圖1）。得到車前草不同藥用部位共有峰9個，保留時間分別為10.895，12.952，14.878，18.149，19.787，21.281，21.832，24.165，28.122 min。

2.2 共有峰指認及相似度評價

采用車前指紋圖譜的色譜條件，根據保留時間并結合紫外吸收光譜全波長掃描等方法，通過與大量的對照品進行色譜比對，確定了車前草指紋圖譜中9個共有峰中3個峰的歸屬：6號峰為蘆丁，7號峰為毛蕊花糖苷，8號峰為二氫槲皮素。分別對車前根、葉、子、剩余部位的指紋圖譜進行相似度計算。結果見表1，除車前子外，車前根、葉、剩余部位的相似度較高，都大于0.93。由于車前子三個已知成分含量遠遠少于其他各部位，且其他峰信息量也較少，因此車前子相似度對于其他入藥部位有所差別；同時葉的峰信息量和其豐度都比其他各部位大，其相似度與根和子也有差別，說明車前藥材各部位在具有一定的相似度的同時也存在部分差異。

表1 車前草不同藥用部位指紋圖譜相似度評價結果

圖2 車前草不同藥用部位NO抑制率

圖3 車前草不同藥用部位對腫瘤細胞抑制率

圖4 車前草不同藥用部位與Vc對DPPH自由基清除作用

2.3 抗炎活性

通過構建LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型，Griess試劑法測定細胞培養液中NO釋放量，能直觀反映炎癥的發生，因此以評價NO分子的分泌量來篩選抗炎藥物是一種普遍運用且簡單可行的方法[11]。本研究結果顯示，與正常對照相比，車前草不同藥用部位在選定的濃度范圍內（0.04-0.1 g·mL-1）對Raw 264.7細胞活力無顯著影響，說明藥物在選定的濃度范圍內無細胞毒作用。NO抑制率隨藥物濃度的增加而增大，說明車前草不同藥用部位均有較好的抗炎作用，其中車前葉的抗炎作用最強，其次為車前草剩余部位和車前根，車前子抗炎作用相對較弱（與空白組抑制率為零相比，各藥用部位P均＜0.05）（圖2）。

2.4 抗腫瘤活性

車前草不同藥用部位對HepG2肝腫瘤細胞均具有顯著抑制作用，且隨著給藥濃度的增加，抗腫瘤作用增強。其中車前葉的抗腫瘤作用最強，其次為車前草剩余部位和車前根，車前子的抗腫瘤作用最弱。（與空白組抑制率為零相比，各藥用部位P均＜0.05）（圖3）。

2.5 抗氧化活性

DPPH是一種穩定的自由基，當還原劑存在時，可顯著清除其自由基，因此廣泛用于評價天然的抗氧化活性[12]。ABTS+是一種含氮自由基，在結構中N原子上含有一對孤對電子，孤對電子與抗氧化劑結合使ABTS溶液顏色發生變化，如果所需要抗氧化劑的濃度越小，表明其清除能力越強[13]。陽性Vc對DPPH?自由基有清除作用，清除率與質量濃度存在一定的量效關系，呈一定線性，可見本方法是可靠的（圖4）。車前不同部位醇提物在試驗質量濃度范圍內，均具有較強的DPPH清除能力，隨質量濃度增加，清除率上升，清除率與質量濃度存在一定的量效關系。其中車前葉的清除DPPH能力最強，其次分別為車前草剩余部位、車前子，車前根抗氧化能力較弱（與Vc相比，各不同藥用部位P＜0.05）。同樣的結果可見ABTS+自由基清除能力（圖5）。

3 討論

車前草有廣泛的臨床用途、藥源豐富、廉價易得、具有很大的開發價值，逐漸引起國內外學者的重視。藥典規定車前用藥部位為車前科植物車前或平車前干燥全草或其干燥成熟種子，針對不同的疾病，合理應用不同的藥用部位，增強中藥臨床療效，精準用藥，是現代中藥研究的內容之一[14,15]。

本研究以車前根、葉、子以及車前草剩余部位為研究對象，采用指紋圖譜技術從宏觀角度對其整體信息進行了整合，建立了車前藥材4個不同藥用部位醇提物的指紋圖譜，結果發現車前不同藥用部位醇提物化學成分之間既有相關性，又有區別，各共有色譜峰的相對峰數量及面積有一定差異，即化學成分種類及含量均有差異。

對車前藥材的不同藥用部位進行了體外抗炎、抗腫瘤和抗氧化活性研究，藥效學數據顯示，在相同的作用時間以及藥物濃度下，車前草的四個藥用部位均有較好的藥理活性，其中車前葉的抗炎、抗腫瘤及抗氧化活性均最高，表明車前葉具有很好的藥理活性。車前草剩余部位和車前葉具有相似的成分及藥理藥效活性，但藥效活性較車前葉低。車前根與車前子相比，車前子的抗炎和抗腫瘤活性較弱，但其抗氧化活性大于車前根。因此，車前草除有利尿緩瀉作用外，其抗炎、抗腫瘤、抗氧化也有較好的藥理活性。對于車前草不同藥用部位藥效活性差異以及具體發揮作用的成分及其作用機制還需進一步研究。

圖5 車前草不同藥用部位與Vc對ABTS自由基清除作用

本研究為進一步擴大車前藥材的臨床用藥，不同藥用部位的藥效物質基礎深入研究提供一定的數據依據，為中藥材不同藥用部位的合理使用提供研究方法，對車前的開發和應用以及車前藥用部位資源的擴展及其進一步的開發應用具有重要的參考作用。