豬屎豆提取物的化感作用研究

趙 艷 ，唐努康 ，高曉余

（1.普洱學院農(nóng)林學院，云南普洱 665000；2.云南農(nóng)業(yè)大學生物大數(shù)據(jù)學院，云南昆明 650201；3.云南省生物大數(shù)據(jù)重點實驗室，云南昆明 650201）

豬屎豆（Crotalaria pallidaAit.）為豆科蝶形花亞科豬屎豆屬植物，分布于美洲、非洲、大洋洲、亞洲熱帶及亞熱帶地區(qū)[1]，為外來入侵植物[2]。國內(nèi)外學者對多種豬屎豆屬植物進行了研究，發(fā)現(xiàn)豬屎豆屬植物具有廣泛的生物活性，主要含有黃酮類物質(zhì)、生物堿及苷類等成分[3-5]。豬屎豆具有粗生易種的特點[6]。可以通過根瘤菌的作用來制造氮肥，改良土壤，綠化護坡效果好，適用于熱帶、亞熱帶公路、堤壩的邊坡水土保持及生態(tài)恢復工程[7-8]。

化感作用是通過植物向環(huán)境中釋放化感物質(zhì)來實現(xiàn)的。植物化感物質(zhì)主要包括酚類、萜類、生物堿等次生代謝物質(zhì)。豬屎豆中的生物堿類屬于化感物質(zhì)，但目前尚無研究系統(tǒng)地評價豬屎豆的化感作用。為此，筆者通過溶劑浸提法得到豬屎豆乙醇提取物，采用種子萌發(fā)法評價豬屎豆乙醇提取物的化感作用；隨后獲得不同極性溶劑的萃取物，結(jié)合生物活性測定，明確各種萃取物的化感作用，旨在為豬屎豆中化感活性物質(zhì)的分離、鑒定及活性應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

豬屎豆地上部分于2017年12月采集于普洱學院附近，陰干至半干狀態(tài)，放于80℃烘箱中，恒溫烘干，粉碎待用。

1.2 供試植物種子

玉米（Zea maysL.）、蘿卜（Raphanus sativusL.）、萵苣（Lactuca sativaL.）和鬼針草（Bidens pilosaL.）種子均購于普洱市當?shù)氐姆N子公司。

1.3 儀器與試劑

電熱鼓風干燥箱（DHG-9070A型）、超聲波清洗機（歌能）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S28s）、循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-III型）、電子天平、IKA RV 10數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、人工氣候箱（PXZ智能）。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇均為市售分析純。

1.4 提取物的制備

1.4.1 豬屎豆乙醇提取物的制備。將粉碎的豬屎豆按1∶3的質(zhì)量體積比（w/v）加入無水乙醇，全部浸沒，攪拌均勻。并于80℃水浴鍋中恒溫浸泡24 h后，超聲波（頻率：35 Hz）輔助萃取60 min，抽濾得濾液。重復3次，合并濾液，將濾液減壓濃縮脫去溶劑得到乙醇提取物。

1.4.2 不同溶劑萃取物的制備。稱取一定量的豬屎豆乙醇提取物，用適量蒸餾水溶解，采用溶劑極性梯度萃取法，分別依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取3次，合并相應(yīng)萃取液。將各萃取液和剩余的水溶液分別在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮至膏狀，即得各萃取物。

1.4.3 種子萌發(fā)法測定生物活性。采用濾紙培養(yǎng)皿法[9]，在鋪有一張定性濾紙的直徑15.0 cm培養(yǎng)皿中，放入已用0.1%高錳酸鉀消毒10 min后浸種膨脹均勻一致的種子各10粒，加入15 mL的提取物溶液，蓋上皿蓋。設(shè)置相應(yīng)的空白對照及溶劑對照。不同組設(shè)置6個重復，每組共計測定60粒種子。在人工氣候箱中培養(yǎng)，每天補充適量蒸餾水以保持濾紙濕度（光照時間12 h）。連續(xù)5 d記錄發(fā)芽數(shù)（胚根突破種皮2 mm即視為萌發(fā)），第5 d記錄根長和株高。

1.5 指標計算方法

化感效應(yīng)參照化感效應(yīng)指數(shù)（respondse index，RI）進行[10]。

其中C為對照值，T為處理值。RI＞0為促進作用，RI＜0 為抑制作用。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗所得數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS18.0等軟件進行統(tǒng)計分析，利用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和S-N-K（S）法比較不同處理組間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬屎豆乙醇提取物對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

2.1.1 豬屎豆乙醇提取物對4種植物種子萌發(fā)的影響。采用濾紙培養(yǎng)皿法測定豬屎豆乙醇提取物對4種植物種子萌發(fā)和幼苗生長的化感作用。由表1可知，與溶劑對照相比，豬屎豆乙醇提取物對玉米種子萌發(fā)整體上表現(xiàn)為低濃度抑制，高濃度促進，但影響不明顯。在豬屎豆乙醇提取物濃度0.010 g/L時，對種子萌發(fā)的抑制作用與對照差異性顯著；不同濃度豬屎豆乙醇提取物對蘿卜種子萌發(fā)的影響不明顯，各組萌發(fā)率都達到90%以上，與對照差異性不顯著；不同濃度豬屎豆乙醇提取物對萵苣種子萌發(fā)表現(xiàn)為低濃度影響較小，高濃度抑制作用，且隨著濃度增大，抑制作用呈增強的趨勢，1.280 g/L豬屎豆乙醇提取物可顯著抑制萵苣種子萌發(fā)（P＜0.05）；豬屎豆乙醇提取物對鬼針草種子萌發(fā)整體表現(xiàn)為抑制作用，且隨著濃度的增大，抑制作用呈增強趨勢，在0.160～1.280 g/L范圍內(nèi)，抑制種子萌發(fā)與溶劑對照差異性顯著（P＜0.05）。

2.1.2 豬屎豆乙醇提取物對4種植物幼苗根長的影響。與溶劑對照相比，豬屎豆乙醇提取物對玉米和萵苣植株幼苗根長的影響整體上表現(xiàn)為低濃度促進高濃度抑制。在1.280 g/L時，對幼苗根長的抑制作用與對照差異性顯著（P＜0.05）；在0.005～0.320 g/L 范圍內(nèi)，對根長的影響體現(xiàn)為先促進后抑制的作用，但均與對照組差異不顯著（表2）。

與溶劑對照相比，豬屎豆乙醇提取物對蘿卜和鬼針草植株幼苗根長的影響整體上表現(xiàn)為低濃度無明顯影響，高濃度顯著抑制。即在濃度大于等于0.160 g/L時，對種子萌發(fā)的抑制作用與對照差異性顯著（P＜0.05）；在 0.005～0.160 g/L 范圍內(nèi)，對根長的影響無明顯規(guī)律，與對照組差異不顯著（表2）。

2.1.3 豬屎豆乙醇提取物對4種植物幼苗苗高的影響。由表3可知，與溶劑對照相比，豬屎豆乙醇提取物對玉米、蘿卜、萵苣和鬼針草幼苗苗高的影響整體上表現(xiàn)為低濃度顯著促進，高濃度顯著抑制。在豬屎豆乙醇提取物濃度為0.640～1.280 g/L時，對鬼針草幼苗苗高具有顯著的抑制作用（P＜0.05）；在豬屎豆乙醇提取物濃度為1.280 g/L時，對玉米、蘿卜和萵苣幼苗苗高具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。

表3 豬屎豆乙醇提取物對4種植物幼苗苗高的影響cm

2.2 豬屎豆乙醇提取物對種子萌發(fā)和幼苗生長的化感綜合效應(yīng)

將種子萌發(fā)率、幼苗根長和苗高進行綜合分析，反映出豬屎豆乙醇提取物對玉米、蘿卜、萵苣、鬼針草的總體化感作用強度。由表4可知，豬屎豆乙醇提取物對玉米種子萌發(fā)、幼苗根長和苗高的化感綜合效應(yīng)，低濃度時RI為正值，說明乙醇提取物具有促進作用，高濃度時RI為負值，說明乙醇提取物具有化感抑制作用。豬屎豆乙醇提取物對蘿卜種子萌發(fā)和苗高的化感綜合效應(yīng)，低濃度時RI為正值，說明乙醇提取物具有促進作用，高濃度時RI為負值，說明乙醇提取物具有化感抑制作用；豬屎豆乙醇提取物對蘿卜根長的化感綜合效應(yīng)，RI均為負值，說明乙醇提取物具有化感抑制作用。豬屎豆乙醇提取物對萵苣種子萌發(fā)、幼苗根長和苗高的化感綜合效應(yīng)，低濃度時RI為正值，說明乙醇提取物具有促進作用，高濃度時RI為負值，說明豬屎豆乙醇提取物具有化感抑制作用。豬屎豆乙醇提取物對鬼針草種子萌發(fā)、幼苗根長和苗高的化感綜合效應(yīng)，RI均為負 值，說明豬屎豆乙醇提取物具有化感抑制作用。

表4 豬屎豆乙醇提取物對4種植物生長的化感效應(yīng)指數(shù)的影響

2.3 豬屎豆不同溶劑萃取物對玉米種子萌發(fā)和幼苗生長的化感綜合效應(yīng)

以玉米種子為供試材料，進一步研究了不同極性溶劑萃取物的化感作用。將不同濃度不同極性溶劑的萃取物處理下玉米種子萌發(fā)率、幼苗根長和苗高數(shù)據(jù)進行綜合分析。結(jié)果表明，石油醚、正丁醇萃取物對玉米萌發(fā)率的RI≤0，說明石油醚、正丁醇萃取物對玉米種子萌發(fā)具有化感抑制作用。4種萃取物對玉米根長的RI＞0，說明4種萃取物對玉米根長生長具有促進作用。石油醚萃取物對玉米苗高的RI＜0，說明石油醚萃取物對玉米苗高生長具有化感抑制作用。乙酸乙酯、正丁醇和水相萃取物對玉米苗高的RI＞0，說明此3種萃取物對玉米苗高生長具有促進作用（表5）。

表5 4種不同萃取物對玉米生長的化感效應(yīng)指數(shù)的影響

3 結(jié)論與討論

植物通過向環(huán)境釋放化感物質(zhì)，進而影響周圍種子萌發(fā)及幼苗生長發(fā)育[1，11-12]。因此，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、苗高和根長等往往被視為衡量化感效應(yīng)強弱的重要指標。該研究結(jié)果表明，豬屎豆乙醇提取物對玉米種子萌發(fā)、幼苗根長和苗高，對蘿卜萌發(fā)率和幼苗苗高，對萵苣根長，整體表現(xiàn)為低促高抑作用，與常見入侵植物的化感作用相一致[13]；對蘿卜萌發(fā)率，對萵苣萌發(fā)率和幼苗苗高，整體表現(xiàn)為促進作用；對鬼針草種子萌發(fā)、幼苗根長和苗高，整體表現(xiàn)為抑制作用。由此說明豬屎豆乙醇提取物對供試植物具有化感作用。

為了探索豬屎豆乙醇提取物化感作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，以玉米種子為供試材料，進一步研究了不同極性溶劑的萃取物的化感作用。結(jié)果表明，豬屎豆乙醇提取物的不同極性溶劑萃取物對玉米種子萌發(fā)和幼苗生長不同指標具有不同的化感作用特點。石油醚、正丁醇萃取物對玉米種子萌發(fā)具有化感抑制作用，石油醚萃取物對玉米苗高生長具有化感抑制作用；而石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水相萃取物對玉米幼苗根長生長均具有促進作用，乙酸乙酯和水相萃取物對玉米幼苗苗高具有促進作用。而不同萃取物中究竟是哪些具體物質(zhì)體現(xiàn)出的不同類型的化感作用，還有待利用化學成分分離、純化和鑒定技術(shù)，并結(jié)合生物活性測定來開展深入的研究。