馬鈴薯脫毒技術研究進展

施夏明，齊璐璐，喬寧寧，徐忠東，耿明

（1.合肥師范學院，安徽合肥230601；2.安徽大學，安徽合肥230039）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是無性繁殖作物，病毒和類病毒可通過種薯持續傳播給子代植株[1]，這是制約馬鈴薯現代農業生產，導致產量和質量下降的主要因素。馬鈴薯X病毒（PVX）、Y病毒（PVY）、S病毒（PVS）、卷葉病毒（PLRV）、M 病毒（PVM）、A病毒（PVA）在我國及世界各地廣泛流行。我國馬鈴薯主產區PVS、PVY感染情況尤為嚴重[2]。馬鈴薯病毒脫毒技術對于提高馬鈴薯產量和質量至關重要。現行的馬鈴薯脫毒技術主要包含莖尖分生組織培養法、熱療法、電療法、化學療法、冷凍療法。單獨或聯合使用上述方法，均取得了良好的脫毒效果。筆者綜述了國內外馬鈴薯脫毒技術的發展現狀，為馬鈴薯脫毒技術的研究和推廣提供參考。

1 莖尖脫毒培養技術

植物病毒通過在維管系統中的快速移動來侵染健康組織，而在未形成成熟維管系統的分生組織中，病毒只能在胞間連絲上緩慢傳輸來侵染組織[3]。此外，細胞分裂和病毒復制存在激烈競爭。在分生組織中，細胞分裂非常旺盛，需要消耗大量養分，而病毒復制由于得不到充足的營養而受到明顯抑制[4]。因此，植物的分生組織不含病毒。將植物的分生組織分離出來，進行組織培養即可得到無病毒的脫毒苗。莖尖分生組織脫毒培養技術是應用最為廣泛的一種脫毒方法。近年來，馬鈴薯莖尖脫毒技術的發展研究主要集中在不同產區、不同品種的莖尖脫毒培養基配方及莖尖剝離方式上[5-7]。莖尖脫毒培養基配方研究除了聚焦使用什么樣的激素及其配比來提高脫毒莖尖成活率外，還關注如何提高脫毒莖尖的成苗率。齊恩芳等在莖尖脫毒培養基中添加了0.05%活性炭，莖尖成苗時間提前了13 d，成苗率提升了7.5%[8]。盧艷麗等在莖尖培養基中添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽，顯著抑制了組織褐變，且提高了成苗率[9]。

2 熱療法脫毒培養技術

熱療法的2個重要影響因素是溫度和熱療時間。熱療的原則是不損傷植物組織，但可以使植物病毒的衣殼蛋白變性，從而最大限度地殺死病毒。此外，熱療法還可能通過預防病毒向分生組織細胞運動、抑制病毒復制、降解病毒RNA、促進病毒RNA沉默、減少莖尖中病毒基因組積聚等方式來實現植物脫毒[10]。熱療法對馬鈴薯卷葉病毒最敏感[11]。Abbas等利用37℃熱水浸泡馬鈴薯塊莖2～3 h后，轉入大田播種，卷葉病毒發病率降至最小16.66%[12]。熱療法對其他馬鈴薯病毒，例如PVX、PVS也具有不同程度的抑制作用[13]。熱療法常常配合莖尖分生組織培養，可以顯著提高脫毒效率[10]。蔣瑜等對國際馬鈴薯中心提供的編號B13-6的發芽馬鈴薯塊先進行37℃熱療30 d，然后進行莖尖脫毒培養，結果顯示熱療可提高脫毒效果[14]。馮光惠等對含有PVX、PVY、PLRV、PSTVd（馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒）4種病毒的費烏瑞它、夏波蒂馬鈴薯無菌苗先進行每天38℃熱療4 h，持續4周，然后進行莖尖脫毒培養，結果表明PLRV的脫除率均達到100%，PVX的脫除率均達到65%以上，PVY的脫除率均達到90%以上，最難脫除的類病毒PSTVd的脫除率也達到8%以上[15-16]。尹明華等采用莖尖培養與熱療法反復交互進行，成功脫除了懷玉山地區高山馬鈴薯的PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV 病毒[6]。

3 電療法脫毒培養技術

電療法是一種高效、簡便、快速的脫毒技術方法。其通常將馬鈴薯莖尖、莖段、芽等外植體置于5～100 mA 的電流下，通電處理 5～25 min，然后移入培養基中培養，即可在不影響外植體再生率的基礎上，較好地脫除病毒。電療法脫病毒的原理可能是通過電脈沖加熱植物組織，使病毒的核酸變性，從而達到殺滅病毒的療效[17-18]。馬鈴薯電療法脫毒技術在我國的運用并不多見，而在國外，此技術方法的運用較為廣泛。國外學者運用此方法已成功脫除PVX[17，19]、PVY[20-23]、PLRV[23-24]、PVA[21]、PSTVd[24]。

4 化學療法脫毒培養技術

化學療法脫毒培養技術采用的化療藥物最常見的是利巴韋林。利巴韋林在1972年被人工合成，試驗證據表明其可以抑制大多數動物RNA病毒和DNA病毒的復制，是高效的抗病毒藥物[25]。1982年Klein等為了獲取無PVX種苗，利用添加了利巴韋林的液體培養基來培養馬鈴薯莖尖，結果顯示10 μg/mL利巴韋林可以脫除80%～83%莖尖的PVX，6～8個月后莖尖發育成完整的植株。但是各種濃度的利巴韋林對植物生長均可產生毒害作用，當利巴韋林的濃度達到 100 μg/mL 時，致死莖尖[26]。2008 年 Dhital等利用添加了20 mg/L利巴韋林的MS培養基培養電療過后的馬鈴薯莖尖，相對于單一電療法，顯著增加了PLRV和PVY的脫毒率[23]。2014年Yang等將各自感染了 PVA、PLRV、PVS、PVX、PVY 的馬鈴薯小植株和混合感染了PVM、PVS、PVY的馬鈴薯小植株培養在含有不同濃度利巴韋林的MS培養基中，經過2～3代的繼代培養，發現75～150 mg/L利巴韋林可以高頻獲取脫毒種苗[27]。2015年Singh等將PLRV陽性的馬鈴薯外植體培養在含有5～30 mg/L利巴韋林的MS培養基中，結果顯示隨著利巴韋林濃度的增加，馬鈴薯植株的再生率顯著降低，脫毒率顯著增加，當利巴韋林濃度達到25 mg/L時，再生率和脫毒率達到了最佳組合，再生率達到36.80%，脫毒率達到39.62%[28]。2017年Kushnarenko等將馬鈴薯莖尖冷凍處理后，再用含有利巴韋林的培養基培養3代，獲得了100%無毒馬鈴薯苗[29]。以上研究表明利巴韋林對廣泛流行的6種馬鈴薯病毒均有不同程度的抑制作用。

化學療法脫毒技術采用的化療藥物除了利巴韋林外，還有一些其他藥物的應用實例，例如1 000 mg/L乳鐵蛋白通過噴霧法或者聯合組織培養法可有效抑制PVX[30]。富含25 mg/L 2-硫尿嘧啶的MS培養基培養卷葉病毒陽性的馬鈴薯外植體，可得到30.55%的再生率和38.68%的脫毒率[28]。此外還有些化療藥物在脫毒的同時幫助提升植株的再生率，例如水楊酸預處理聯合冷凍療法可增強馬鈴薯植株的存活率并可清除PVS[31]。水楊酸聯合利巴韋林和電療法在有效清除PLRV和PVY的同時，顯著提升馬鈴薯苗的再生率，最高達72.7%[23]。

5 冷凍療法脫毒培養技術

相對于傳統的莖尖脫毒培養技術，冷凍脫毒培養是一種更高效、更簡便的脫毒培養技術[32]。植物病毒量會隨著離頂端分生組織距離的減小而減少。頂端分生組織的細胞含有高濃度胞質，而距離分生組織較遠的莖尖細胞含有較多水分。在-196℃的冰凍條件下，水分含量大的細胞會被胞內形成的冰晶崩解，而擁有高濃度胞質的細胞可以抵抗冰凍。因此，低溫療法是基于超低溫對細胞選擇性破壞的原理，殺死帶有病毒且水分含量大的莖尖細胞，保存不含病毒或含少量病毒的分生組織細胞，結合組織培養技術，而得到無毒種苗[33-34]。目前，國內外科學家已采用馬鈴薯冷凍療法脫毒技術成功高效脫除了PVM、PVX、PVY、PVS、PLRV、PSTVd[29，31，35-39]。

6 結語

馬鈴薯品種繁多，馬鈴薯病毒的種類亦繁多。每一品種馬鈴薯感染的每一種病毒對每一種脫毒技術的敏感性均有不同，這就需要研究者深入尋找最佳的脫毒方案。此外，每一種脫毒技術均具有一定的局限性，需要研究者聯合2種或更多種的脫毒技術同時干預馬鈴薯病毒，使脫毒技術間優勢互補，才能獲得理想的馬鈴薯脫毒種質。例如，科學家運用莖尖分生組織脫毒技術、冷凍脫毒技術、化學療法聯合熱療法脫毒技術分別對挪威當地8種傳統栽培品種馬鈴薯進行脫毒試驗，結果發現其中4個品種的馬鈴薯通過莖尖分生組織脫毒技術脫除病毒，沒有1個品種的馬鈴薯通過冷凍脫毒技術脫除病毒，而8個品種的馬鈴薯均通過化學療法聯合熱療法不同程度地脫除了病毒[40]。

馬鈴薯是全球第4大糧食作物，我國是最大的馬鈴薯生產國[41]。我國已啟動馬鈴薯主糧化戰略。馬鈴薯種質資源的脫毒情況嚴重影響我國馬鈴薯的產量和品質及糧食安全。因此，簡便易行、安全高效、脫毒周期短的脫毒技術研究和推廣是馬鈴薯主糧化戰略的必然要求。