甲氨蝶呤聯合異環磷酰胺對骨肉瘤細胞系增殖和凋亡的影響

肖艷 丁婷

骨肉瘤是未成熟骨組織或惡性增生間質細胞產生的骨樣組織構成的惡性腫瘤，多發生在20歲以下的兒童或青少年，占兒童腫瘤的5%，惡性程度高，危害嚴重，死亡率較高[1～3]。臨床上，骨肉瘤的治療主要以手術聯合放化療為主，但其對化療和放療敏感性較低，尚未有特效治療方法，臨床治療效果欠佳。甲氨蝶呤（MTX）是國家批準的治療骨肉瘤的一線化療藥，具有較好效果，但隨著耐藥現象的產生，其療效也逐漸降低[4，5]。異環磷酰胺是1988年12月獲美國FDA 批準主要適用于軟組織腫瘤、睪丸腫瘤、惡性淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌及兒童腫瘤的化療藥物[6，7]。本研究在體外實驗中探討甲氨蝶呤聯合異環磷酰胺對骨肉瘤U2-OS 細胞增殖和凋亡的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料采用人骨肉瘤細胞系U2-OS，購買于中科院上海細胞庫；甲氨蝶呤（MTX）、異環磷酰胺（IFO）均購自美國Sigma 公司，并按照說明書融于對應的液相中。DMEM 高糖培養基購買于Hyclone公司，胎牛血清購買于美國Gibco 公司，并使用DMEM 培養基和胎牛血清按照9∶1的比例配置成含10%血清的培養基以培養細胞。磺酰羅丹明（SRB）購買于Sigma 公司，Annexin V 凋亡試劑盒購買于賽默飛公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 U2-OS 細胞系使用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基培養，培養條件為5%的CO2，溫度37℃。細胞密度達到90%后按照1∶3 進行傳代，一般情況下一周可傳2～3 代。

1.2.2 SRB 法檢測細胞增殖 分別使用MTX和IFO作用于U2-OS 細胞系，計算出U2-OS 細胞對MTX和IFO的半抑制濃度（IC50）值。然后按不同用藥方法分為異環磷酰胺（IFO）組、甲氨蝶呤（MTX）組、甲氨蝶呤聯合異環磷酰胺（MTX+IFO）組，IFO和MTX使用半抑制濃度值濃度，比較各組細胞的細胞活性并繪制生長曲線。具體實驗方法：①收集對數生長期的骨肉瘤U2-OS 細胞，調整細胞懸液濃度并按照上述分組接種于96 孔板，每組設立3個復孔；②細胞培養24h 后，各組分別加入含有對應藥物及濃度的培養基，組別周邊使用PBS 進行封板，防止邊緣效應產生；③細胞培養至預定時間后終止，每孔去上清液，并加入200μl 濃度為10%的三氯乙酸溶液（TCA），4℃固定50min；④使用蒸餾水連續洗板5次，室溫晾干；⑤每孔加入100μl 磺酰羅丹明（SRB）染液，室溫下染色30min；⑥棄染液，使用濃度為1%的冰乙酸洗板5次，確保洗去浮色后室溫下避光晾干；⑦每孔加入150μl 濃度為10mM的Trisbase 溶液，室溫條件下于搖床高速震蕩15min，使孔內SRB染液結晶完全溶解；⑧使用酶標儀在波長為515nm處測定96 孔板各孔的OD 值。

1.2.3 凋亡實驗 對數期U2-OS 細胞，用無血清培養基調整細胞懸液密度，分為對照組、IFO組、MTX組、MTX+IFO組，每組3個復孔。具體實驗方法：①取1ml 上述細胞懸液，接種于6 孔板中，分別加入各組對應藥物；②收集6 孔板各組細胞全部上清液和6 孔板貼壁細胞于5ml 離心管中，1 000g 離心5min，棄上清；③PBS 洗滌細胞1次，1 000g 離心5min，棄上清，用含1%胎牛血清DMEM 培養基調整細胞密度為5×105個/ml；④取100μl 細胞懸液于1.5ml EP 管中，加入凋亡試劑100μl，輕柔充分混勻，室溫避光孵育30min；⑤300 目尼龍網濾過后，上機檢測。

1.3 統計學分析所有數據均采用SPSS 17.0 統計學軟件處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。實驗數據使用GraphPad Prism 軟件進行制圖。

2 結果

2.1 MTX和IFO 作用于U2-OS 細胞的IC50MTX和IFO 均按照1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml、80mg/ml 設置濃度梯度。實驗發現，MTX 對U2-OS 細胞的IC50為（19.99±0.12）mg/ml，而IFO 對U2-OS 細胞的IC50為（32.07±0.69）mg/ml，見圖1。

圖1 MTX和IFO 抑制U2-OS 細胞增殖的IC50

2.2 MTX、IFO 及MTX 聯合IFO 對U2-OS 細胞增殖的影響研究顯示，MTX和IFO 均能抑制U2-OS細胞的增殖，且在16h、32h 及48h MTX的抑制效果優于IFO，差異有統計學意義（P＜0.05），而當MTX和IFO 聯合使用時，對細胞的抑制效果更為明顯，與MTX組或IFO組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2 及表1。

圖2 MTX、IFO 及MTX+IFO 對細胞增殖的影響

表1 MTX、IFO 及MTX+IFO 對細胞增殖的影響

2.3 MTX、IFO 及MTX 聯合IFO 對U2-OS 細胞凋亡的影響實驗發現，骨肉瘤U2-OS 細胞的凋亡率為4.25%，使用MTX 處理后細胞凋亡率上升為9.1%，而使用IFO 后細胞凋亡率為6.5%，MTX組和IFO組細胞凋亡率較對照組均顯著上升，且MTX組的凋亡率高于IFO組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而MTX和IFO 聯合作用后，細胞凋亡率上升為19.90%，較對照組、MTX組和IFO組均顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 MTX、IFO 及MTX+IFO 對U2-OS 細胞凋亡的影響

3 討論

骨肉瘤是臨床常見的骨科腫瘤，具有惡性程度高、致殘率和死亡率高等特點，嚴重威脅患者的生命安全，骨肉瘤對放化療敏感性較差，因此手術成為重要的治療手段，但5年生存率低，轉移復發率高[8～10]。隨著醫學水平的不斷提高，化療藥物得到不斷的發展，新輔助化療也成為骨肉瘤手術治療的有效補充，可明顯提高患者5年生存率和生活 質量。

MTX與葉酸結構類似，是一種通過抑制二氫葉酸還原酶而發揮作用的抗葉酸類抗腫瘤藥物，其作用機理為通過抑制二氫葉酸還原酶進而阻滯脫氧胸腺苷和嘌呤腺苷合成，干擾RNA和蛋白質合成，從而阻止細胞增殖，對白血病以及多種實體腫瘤都有較好的臨床效果[11，12]。但臨床MTX 單藥使用需要較大劑量，在起到療效的同時給患者帶來肝功能損害、腎功能衰竭、骨髓抑制、胃腸道反應、感染等嚴重并發癥，不僅影響療效，嚴重者還會導致患者死亡[13]。因此，MTX 多與其他化療藥物聯合使用，在制劑間的修飾作用、用藥劑量、投藥順序等方面進行調整而組成的化療方案在臨床取得較好效果，MTX也成為我國一線抗腫瘤化療藥物[14，15]。IFO 是磷酰胺類的衍生物，是第4個用于骨肉瘤化療的藥物，自1988年被FAD 批準用于臨床后，其抗腫瘤作用就得到廣大醫護人員的關注。IFO 對骨肉瘤有較好的臨床療效，且不良反應較輕，是一種治療骨肉瘤的關鍵化療藥物，臨床多用于對常規化療失敗的患者[16]。

目前，細胞增殖和凋亡在腫瘤形成過程中的重要作用已經得到普遍認可，細胞的惡性增殖和凋亡減少是腫瘤形成的重要原因。因此，化療藥物調控細胞的增殖和凋亡是近年來腫瘤研究的熱點。王亞鵬等[17]研究證實，褪黑素聯合順鉑、甲氨蝶呤在體外作用于骨肉瘤細胞，可有效增加細胞凋亡，抑制其增殖，從而起到抗腫瘤作用。王建軍等[18]研究顯示，IFO 對人骨肉瘤Saos-2 細胞株有抑制作用。本研究旨在探討MTX和IFO 在體外對骨肉瘤細胞U2-OS增殖及凋亡的影響，以及二者聯合使用的效果。研究證實，體外實驗中MTX和IFO 對U2-OS 細胞都具有抗增殖和促凋亡作用，且MTX 作用更為明顯，而當MTX 聯合IFO 使用時，其抗增殖和促凋亡作用有較大幅度的提升，因而我們認為MTX和IFO 對U2-OS的增殖抑制和促進凋亡作用具有一定的協同作用，猜測這可能與二者對細胞凋亡或增殖相關信號通路有交叉影響有關，但具體的分子機制尚未闡明，還需要進一步研究。

綜上所述，MTX和IFO 均可抑制骨肉瘤細胞U2-OS 細胞增殖并促進凋亡，而MTX的作用較IFO 更為明顯；MTX和IFO 具有一定的協同作用，兩者聯合使用對U2-OS 細胞的增殖抑制和促凋亡作用更為顯著。