硝酸銀滴定液指示劑法測定獸藥鹽酸氯苯胍中含氯量的方法驗證

(浙江匯能生物股份有限公司，浙江 海寧 314422)

鹽酸氯苯胍(Robenidine hydrochloride)又名1,3-雙[(對氯亞芐基)氨基]胍鹽酸鹽，屬胍鹽衍生物，分子式為C15H13Cl2N5·HCl，分子量為370.66。鹽酸氯苯胍作為廣譜抗球蟲藥被用于預防和治療雞、兔等動物的球蟲病，對柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲等均有效果[1-3]。《中國獸藥典》(2015版)在鹽酸氯苯胍質量標準要求【檢查】項中規定了其含氯量的滴定檢測方法，該方法需使用到兩種化學檢測試劑，即二苯偕肼(用作指示劑)和硝酸汞(用作滴定液)。硝酸汞是一種劇毒危化品，在我國被嚴格管控，購買十分困難，給鹽酸氯苯胍生產或使用單位開展對該藥的經常性質量監測帶來極大不便，找出一種能替代硝酸汞滴定法的檢測方法尤為必要。

目前已有采用硝酸銀滴定法檢測工業循環冷卻水和鍋爐用水中氯離子的方法報道(GB/T 15453-2008)。雖然硝酸銀屬于易制爆危險化學品，但和硝酸汞相比易于購買，毒性亦較低。本試驗建立了一種以硝酸銀作為滴定液、以熒光黃作為終點指示劑的鹽酸氯苯胍中含氯量的檢測方法，該檢測方法結果準確可靠。該方法不僅可替代硝酸汞滴定法，也有利于保障檢驗人員的健康。

1 試劑與方法

1.1試劑 硝酸銀滴定液(0.10225 mol·L-1)：取硝酸銀17.5 g，加水適量使溶解成1000 mL，搖勻。取在110℃干燥至恒重的基準氯化鈉約2.0 g，精密稱定，加水50 mL使溶解，再加糊精溶液5 mL，碳酸鈣0.1 g與熒光黃指示劑8滴，用本液滴定至渾濁液由黃綠色變為微紅色。每1 mL硝酸銀滴定液(0.1 mol/L)相當于5.844 mg的氯化鈉。

硝酸汞滴定液(0.05002 mol·L-1)：取硝酸汞17.2 g，加水400 mL和硝酸5 mL溶解后，濾過，再加水適量使成1000 mL，搖勻。取在110℃干燥至恒重的基準氯化鈉約0.15 g，精密稱定，加水100 mL使溶解，加二苯偕肼指示液1 mL,在劇烈振搖下使用本液滴定至淡玫瑰紫色。

熒光黃指示劑：取熒光黃0.1 g，加乙醇100 mL使溶解。

糊精：取糊精2.0 g，加100 mL水加熱溶解，冷卻搖勻。

二苯偕肼指示液：取二苯偕肼1.0 g，加乙醇100 mL使溶解，搖勻；使用時再取上液1 mL，加乙醇至5 mL，搖勻得0.2%二苯偕肼指示劑。

鹽酸氯苯胍樣品來源：樣品1和樣品2來源于浙江匯能生物股份有限公司，樣品3來源于國內某公司。

其余試劑均為分析純，乙醇純度95%，試驗用水均為純化水。

1.2 試驗方法

1.2.1 硝酸銀滴定法取干燥至恒重的鹽酸氯苯胍樣品約0.30 g，精密稱量后，加入50 mL乙醇加熱溶解。冷卻后，加入2 mL熒光黃指示劑和5 mL 2% 糊精(m∶v)，用硝酸銀滴定液滴定至終點，每1 mL硝酸銀滴定液(0.1 mol·L-1)相當于3.545 mg的Cl。

1.2.2硝酸汞滴定法 按《中國獸藥典》一部(2015版)的檢測方法進行。取干燥至恒重的鹽酸氯苯胍樣品約 0.30 g，精密稱定，置于50 mL乙醇中加熱使溶解, 冷卻后加入0.2%二苯偕肼指示液2 mL, 用硝酸汞滴定液滴定至溶液顯淺玫瑰紅色。每1 mL硝酸汞滴定液(0.05 mol·L-1)相當于3.545 mg的Cl。

2 結果與討論

2.1方法學驗證

2.1.1回歸方程 參照商軍等[4]的方法進行。鹽酸氯苯胍供試品經干燥至恒重，每個樣品稱取7份，使硝酸銀滴定液體積分別達到滴定管體積的20%、30%、40%、50%、70%、80%和90%(滴定管容積為10 mL)。記錄滴定終點時所需硝酸銀的體積，以滴定液體積(vi)為縱坐標，供試品的質量(mi)為橫坐標，采用EXCEL表進行回歸分析，獲得回歸方程。如圖1所示，三個樣品回歸方程的相關系數平方(R2)均接近1。

2.1.2成比例的系統誤差分析 根據前述回歸方程，計算試驗獲得的回歸系數(bobs)與理論值“btheory”。對于指示劑法，測定的“bobs”與理論值“btheory”之間的相對偏差應不得超過0.5%[5]。根據所用硝酸銀滴定液的摩爾濃度和鹽酸氯苯胍的相對分子量計算得出btheory=26.385 mL·g-1。根據所獲得的線性回歸方程可知，3個樣品的回歸系數bobs分別是26.455、26.47和26.514，按[(bobs-btheory)/btheory]×100%公式計算測定值與理論值之間的相對偏差分別為0.265%、0.322%和0.489%，均不超過0.5%(表1)。

2.1.3額外的系統誤差分析 指示劑法獲得的回歸方程截距(aobs)應不得超過預期或目標滴定體積“VT”的0.6%[5]。本方法規定供試品取樣量為0.3 g，預期或目標滴定VT為7.92 mL(VT=26.385×0.3)。根據線性回歸方程，樣品1、樣品2和樣品3測定的回歸曲線的aobs分別為0.0442、0.0347和0.0194，按(aobs/VT)×100%計算，額外的系統誤差分別為0.558%、0.438%和0.245%(表2)，均未超過0.6%。

表1 成比例的系統誤差分析結果

2.1.4精密度分析 精密度即統計學誤差，采用指示劑法時，統計學誤差應不超過0.5%[5]。計算公式如(1)、(2)和(3)所示：

(1)

(2)

Sdd=∑(Vi-aobs-bobs×mi)

(3)

式中SD為標準偏差估計值；Vi為消耗的滴定液體積；mi為供試品的稱樣量，n為滴定的次數。

按上述公式計算，三個供試品的SD分別為0.01006、0.00775和0.00988，統計學誤差分別為0.127%、0.098%和0.125%(表2)，均未超過0.5%。

2.1.5回收率試驗 取樣品1進行加標回收試驗，標準氯選用110℃干燥至恒重的基準氯化鈉。前述檢測表明該樣品中含氯量為9.7%，試驗中向該樣品中添加分別相當于其含氯量的80%、100%和120%的氯，采用硝酸銀滴定法檢測氯含量，計算氯的回收率。檢測結果表明，樣品中氯的平均回收率達 99.4%(表3)，表明該檢測方法成立。

表2 額外的系統誤差和精密度分析結果

表3 加標回收率試驗結果

2.2硝酸銀滴定法與硝酸汞滴定法檢測結果對比 用《中國獸藥典》一部(2015版)要求的方法和本試驗建立的方法分別對鹽酸氯苯胍樣品1和樣品3進行5次平行測定，測得的氯含量見圖2。結果表明，兩種滴定方法測得的氯含量無顯著差異(P>0.05)。表明本試驗建立的硝酸銀滴定法可用于檢測鹽酸氯苯胍中氯含量。

A:《中國獸藥典》(2015版)要求的檢測方法；B：本試驗建立的方法。NS：差異不顯著(P>0.05)(n=5)圖2 樣品氯含量兩種方法檢測結果的比較

3 結論

綜上，本試驗通過成比例的系統誤差、額外的系統誤差、統計學誤差和加標回收試驗分析，證實所建立的以硝酸銀為滴定液、以熒光黃作為終點指示劑的鹽酸氯苯胍中氯含量的滴定檢測方法精密度高、重復性好、方法可靠。此外，本試驗建立的硝酸銀滴定法與《中國獸藥典》一部(2015版)要求的硝酸汞滴定法對同一樣品的檢測結果無顯著差異。上述結果表明，本試驗建立硝酸銀滴定法可以替代硝酸汞滴定法用于鹽酸氯苯胍中氯含量的檢測。