鞘內注射舒芬太尼對慢性神經痛大鼠脊髓背角NMDA受體表達的影響

鄭孝振，韓簫笛，宋俊杰，毛姍姍，白明松，洪道先

（河南大學第一附屬醫院麻醉科，河南 鄭州 475000）

N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）為細胞內的重要信號轉導分子，細胞中分布廣泛，生物學功能復雜。當外周神經發生損傷后，脊神經纖維會釋放出大量的降鈣素基因相關肽和興奮性氨基酸[1-2]，通過激活脊髓背角神經元的突觸后膜，產生快速的突觸電位，從而解除NMDA受體上的壓力，激活NMDA受體，開放鈣離子，進一步增加NMDA受體的數量，增強突觸后神經元的興奮性。有研究報告表明，舒芬太尼可有效緩解神經病理性疼痛程度[3-4]。本研究旨在評價鞘內注射舒芬太尼對神經性痛大鼠脊髓背角內NMDA受體表達的影響，為舒芬太尼在慢性神經痛中的應用途徑、劑量以及效果提供參考依據[5]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取健康清潔級成年雄性SD大鼠，購自上海生工動物實驗中心，體質量200～250 g，自由進食，溫度22℃～25℃，濕度55%左右，晝夜比1︰1，適應環境1周后進行實驗分組。隨機選擇5只作為空白對照組，其余大鼠制備慢性坐骨神經損傷模型，造模成功后隨機分為模型組和觀察組，各15只。

1.2 制備慢性神經痛模型

大鼠經腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，側臥位固定，距股骨下1 cm沿股骨走形切開皮膚，鈍性分離充分顯露右側坐骨神經和周圍組織，游離主干分叉以前約8 mm，含鉻羊腸線在神經起始點2 mm處將坐骨神經結扎4道，每道相隔1 mm，局部生理鹽水沖洗，間斷縫合皮下組織。以大鼠出現縮足、舔尾等行為，疼痛陽性反應為建模成功。

1.3 實驗方法

觀察組鞘內注射舒芬太尼1 μg+氯化鈉注射液稀釋至10 μL，模型組注射等量0.9%氯化鈉注射液；分別于造模后即刻、3 d和5 d評價運動功能，熱縮足反射潛伏期法（TWL）檢測疼痛閾值，免疫組化染色法檢測脊髓背角NMDA受體陽性表達。

1.4 鞘內注射

建模后2 h大鼠吸入異氟烷麻醉，俯臥位固定，選取L3～L4間隙為切口位置，縱形切口長度3 cm，鈍性分離肌肉組織，顯露L3～L4脊突間隙；利用25 G針穿刺黃韌帶和硬脊膜，待腦脊液流出視為穿刺成功。將導管經硬脊膜口緩慢插入8 cm，開口端固定于L1～L2，另一端經皮下隧道在頸背部引出，外露2 cm將導管口夾閉并固定。待大鼠麻醉失效后，微量注射10 μL舒芬太尼或0.9%氯化鈉注射液，以10 s內雙肢出現無法負重、無逃避反應且20 min可恢復為注射成功。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 運動功能評分：0分為運動功能無改變，可以正常行走；1分為運動輕度受限，足底刺激可出現正常縮爪反應；2分為自主運動能力減低，中度運動受限；3分為自主活動完全受限，無法行走。

1.5.2 疼痛閾值檢測：把大鼠放在有機玻璃箱中，置于玻璃板上，適應30 min后，采用紅外線光束照射大鼠術側足底中部，至大鼠表現逃避性行為終止，熱刺激基礎強度設定10 s，自動切斷時間設定20 s，每只大鼠測量5次，間隔時間5 min，取平均值。

1.5.3 免疫組化染色法：常規制作脊髓背角組織切片，厚度5 μm，經脫蠟、水化，抗原修復和封閉后；滴加兔抗鼠NMDA受體單克隆抗體一抗（江蘇碧云天科技有限公司，工作濃度1︰2000），置于濕盒內4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌；滴加羊抗兔IgG多克隆抗體二抗（江蘇碧云天科技有限公司，工作濃度1︰500），置于濕盒中27℃孵育20 min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（江蘇碧云天科技有限公司），置于濕盒中27℃孵育20 min，PBS振蕩洗滌5 min×3次；DAB顯色、復染、透明、中性樹膠封片、光學顯微鏡下觀察。結果判定：采用半定量法，依據染色強度和染色細胞所占比率；以胞漿或胞核黃染至深棕色為陽性，染色強度中無陽性染色為0分，弱染色為1分，中等強度染色為2分，強染色為3分；陽性細胞數比率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；兩項乘積0～3分為陰性，4～12分為陽性。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 運動功能評分的比較

造模后即刻模型組和觀察組大鼠的運動功能評分高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；觀察組3 d和5 d運動功能評分逐漸下降，顯著低于造模后即刻，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組不同時間變化差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 運動功能評分比較

2.2 疼痛閾值比較

造模后即刻模型組和觀察組大鼠的疼痛閾值較對照組降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；觀察組3 d和5 d的疼痛閾值較造模后即刻逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組不同時間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 疼痛閾值的比較

2.3 脊髓背角NMDA受體陽性表達比較

造模后即刻模型組和觀察組大鼠脊髓背角NMDA受體陽性表達高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；觀察組3 d和5 d陽性表達較造模后即刻逐漸降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組不同時間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3

表3 脊髓背角NMDA受體陽性表達比較

3 討論

本實驗采用大鼠作為研究對象，大鼠選擇性神經損傷模型（SNI）引起的神經損傷程度穩定，且重復性好，誘發行為表現更加持久，損傷傳入神經元，能夠模擬臨床上神經病理性疼痛的特征，是一種較為穩定的大鼠模型。本研究探討舒芬太尼減輕神經病理性疼痛的機制，選擇術后各個時間點進行觀察，結果發現，造模后即刻模型組和觀察組大鼠的疼痛閾值較對照組明顯降低；觀察組3 d和5 d的疼痛閾值較造模后即刻顯著升高，差異顯著；模型組不同時間點的疼痛閾值比較差異無統計學意義。說明鞘內注射舒芬太尼對神經性痛大鼠的痛覺有顯著改善作用，可減輕神經疼痛。造模后即刻模型組和觀察組大鼠的運動功能評分顯著高于對照組；觀察組3 d和5 d運動功能評分逐漸下降，顯著低于造模后即刻；模型組不同時間點的運動功能評分比較差異無統計學意義。說明舒芬太尼可以在減輕大鼠神經痛的同時，恢復大鼠的運動功能。造模后即刻模型組和觀察組大鼠脊髓背角NMDA受體陽性表達顯著高于對照組；觀察組3 d和5 d陽性表達較造模后即刻逐漸降低，差異顯著。說明建模后大鼠脊髓背角NMDA受體量及陽性表達量增加，使用舒芬太尼后可降低大鼠脊髓背角NMDA的陽性表達，可能是通過抑制降鈣素基因相關肽（CGRP）激活和NMDA釋放有關。大鼠發生神經痛后，導致CGRP表達和脊髓背角神經元NMDA受體上調，提示這兩種受體均參與了神經病理性疼痛的維持和形成。舒芬太尼可通過下調這兩種受體的表達，來減輕疼痛感，但具體作用機制需要進一步研究討論。

綜上所述，鞘內注射舒芬太尼可減少神經痛大鼠脊髓背角NMDA受體的表達，減輕疼痛感，增強運動能力。該研究的創新點在于為舒芬太尼在慢性神經痛中的應用途徑以及效果提供參考依據，但是未能深入分析舒芬太尼對NMDA受體不同亞型的表達水平及作用效應，觀察時間有限，舒芬太尼對慢性神經痛的遠期干預效果還需要進一步驗證。