肛門洗劑對肛瘺模型大鼠創面組織修復作用及創面血管生長相關因子、炎癥相關因子、FGF蛋白的影響?

謝昌營，吳成成，肖慧榮

(江西中醫藥大學附屬醫院，南昌 330006)

肛瘺是一種反復發作的肛腸疾病，主要有流膿、疼痛、瘙癢等局部癥狀，急性炎癥時還可出現發熱、消瘦等全身癥狀且不能自愈。肛瘺術后創口易被糞便污染，一般不做縫合，因此創面修復成為影響預后的重要因素[1]。肛瘺創面修復主要包括炎癥反應階段、細胞增殖階段及組織重塑階段[2]，前兩個階段的發展走向直接影響肛周組織重塑。因此，減輕炎癥反應，增快肛周組織細胞增殖，已然成為治療肛瘺術后的研究方向和熱點。

《醫學流源論》指出：“外科之法最重外治”，說明外治法在治療外科疾病方面占據著首要地位。肛門洗劑是肖慧榮主任醫師通過多年研究而得，在臨床中對肛瘺、混合痔術后創面愈合均有明確療效[3-4]。肛瘺術后減輕早期炎癥反應，重塑創面局部微循環，是提高肛瘺術后創口愈合率的關鍵因素[5-6]。成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)可促進細胞增殖、遷移、分化及血管再生。有研究證實，FGF誘導血管內皮增殖效應強于血小板生長因子[7]。本研究擬采用大鼠背部肛瘺造模法，觀察肛門洗劑對肛瘺模型大鼠創面愈合及創面血流量的影響，并檢測新生肉芽組織中血管生長相關因子、炎癥相關因子、FGF的變化，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

高錳酸鉀(濟南福康生物制藥有限公司)；氯胺酮(福建古田藥業)；HE染色試劑盒(Solarbio公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)；MI191型激光多普勒血流儀(上海埃德國際貿易公司)；VE-180型垂直板電泳裝置(上海天能科技有限公司)；1703940型半干轉膜儀、1708159型凝膠成像系統(美國Bio Rad公司)；前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Assay公司)；白介素-1β(interleukin-1β， IL-1β)，白介素-2(interleukin-2， IL-2)ELISA試劑盒(中國欣博盛)；血管生長因子(vascular growth related factors，VEGF)、胎盤生長因子(placental growth factor， PLGF)、促血管生成素-Ⅰ(angiopoietin-Ⅰ，Ang-Ⅰ)、促血管生成素-Ⅱ(angiopoietin-Ⅱ，Ang-Ⅱ)ELISA試劑盒(美國Cygnus公司)；低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)ELISA試劑盒(美國Abcam公司)；成纖維細胞生長因子-1(FGF-1)、成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)、成纖維細胞生長因子-6(FGF-6)一抗(美國Abcam公司)。

1.2 肛門洗劑組成及制備

肛門洗劑組成：五倍子60 g，苦參60 g，明礬20 g，樸硝20 g，桑寄生20 g，荊芥20 g，黃柏20 g，白及20 g，月石20 g，百部20 g，藥物購自江西中醫藥大學附屬醫院中藥房(批號20140101)。制法：將肛門洗劑原飲片粉碎成粗粉，加水 2 000 mL浸泡 15 min 后武火煮沸煎至500 mL，去渣存液，每150 mL 為1包，使用時按1∶4 稀釋后擦洗創面，紗布包扎。

1.3 動物模型制備及分組

選取清潔級雄性SD大鼠64只，體質量(200±20)g，周齡8～10周，由江西中醫藥大學基礎醫學部實驗動物中心提供(實驗動物許可證號SCXK(贛)2017-019)。采用氯胺酮100 mg/kg腹腔注射進行麻醉，對入組大鼠術區備皮及消毒， 于頸后2.5 cm脊柱旁側0.5 cm切割直徑1.8 cm圓形創口，達肌層0.3 cm深度，止血后創面加糞液1 mL，油紗、敷料固定48 h，以創口有膿性分泌物、有糞臭者為成功標準[8]。將64只SD大鼠采用隨機數字表法分為正常組、模型組、肛門洗劑組及陽性對照組各16只，對照組大鼠造成背部肌層創傷后不敷以糞便，模型組大鼠造模成功后不給予任何藥物涂抹，正常組與模型組均給予0.9%NaCl溶液創面擦洗，每日2次；肛門洗劑組大鼠給予肛門洗劑藥液擦洗創面，每日2次；陽性對照組給予高錳酸鉀溶液(1∶5000)，每日2次，各組大鼠均連續干預14 d[9]。

1.4 創面愈合率

參照潘友珍等[10]方法測量創傷面積，并計算藥物治療7 d、14 d創面愈合率。愈合率=(原始創面面積-當前創面面積)/原始創面面積×100%。

1.5 創面局部血流量、新生毛細血管數檢測

采用激光多普勒血流儀，將 MSP 200xp 表面探頭放置在肛瘺內口創面上，每個創面分別選肛瘺內口的頂端及瘺道走向上任意2點(總計3個點)，每點記錄30 s，采用 PowerLab Chart5 v5.2.2 圖像分析軟件進行圖像分析，計算3點平均值作為該內口創面的血流值。實驗第7天、14天取各組大鼠內口相近處肉芽組織，經10%甲醛固定液固定 45 min后，石蠟包埋、切片，行常規HE染色。采用光學顯微鏡對HE切片進行新生毛細血管數觀察，并采用MPIAS-400 計算機彩色病理圖文分析系統測定新生毛細血管總面積。

1.6 血管生長相關因子及炎癥相關因子檢測

于實驗第7天，在各組大鼠中隨機選取8只取部分肉芽組織，由于切取肉芽組織后影響藥物干預14 d創口面積綜合數據，取樣后處死，其余大鼠于實驗結束取材后處死。冷研磨后加入細胞裂解液2 mL制備組織勻漿，用ELISA法檢測治療7 d、14 d肉芽組織VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ、IL-1β、IL-2及PGE2表達，嚴格按照說明書操作。

1.7 創面組織FGF-1、FGF-2、FGF-6表達

剪取部分創面肉芽組織冷研磨后加入細胞裂解液，在4 ℃條件下以2000 r/min進行離心，測定蛋白量后制備上樣液。取各組待測樣品20 μg加至SDS-PAGE電泳中，轉膜后脫脂牛奶封閉2 h，加入anti-FGF-1(1∶1000)、anti-FGF-2(1∶1000)、anti-FGF-6(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，洗膜3次加入二抗anti-rabbit(1∶1000)，24 ℃條件下孵育2 h，洗膜3次后暗室曝光掃描。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參β-actin灰度值。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠創面局部血流量、新生毛細血管數及其總面積

表1顯示，與治療7 d比較，治療14 d正常組、肛門洗劑組及陽性對照組大鼠創面局部血流量、新生毛細血管數、總面積及創面愈合率均升高(P<0.05)；與正常組比較，模型組治療7 d、14 d創面局部血流量、新生毛細血管數、總面積及創面愈合率均降低(P<0.05)；與模型組比較，肛門洗劑組、陽性對照組大鼠治療7 d、14 d創面局部血流量、新生毛細血管數、總面積及創面愈合率均升高(P<0.05)。

表1 大鼠創面局部血流量、新生毛細血管數及其總面積比較

注:與本組7 d時比較：*P<0.05；與正常組同時間點比較：#P<0.05；與模型組同時間點比較：▲P<0.05

2.2 血管生成相關因子VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表達情況

表2顯示，與治療7 d比較，正常組、模型組、肛門洗劑組及陽性對照組大鼠治療14 d后創面肉芽組織VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表達升高(P<0.05)；與正常組比較，模型組治療7 d、14 d創面肉芽組織VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表達降低(P<0.05)；與模型組比較，肛門洗劑組、陽性對照組大鼠治療7 d、14 d創面肉芽組織VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表達升高(P<0.05)。

表2 大鼠創面肉芽組織VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ含量變化比較

注:與本組7 d時比較：*P<0.05；與正常組同時間點比較：#P<0.05；與模型組同時間點比較：▲P<0.05

2.3 創面肉芽組織炎癥相關因子IL-1β、IL-2及PGE2表達情況

表3顯示，與治療7 d比較，正常組、肛門洗劑組及陽性對照組大鼠治療14 d創面肉芽組織IL-1β、IL-2及PGE2表達降低(P<0.05)；與正常組比較，模型組大鼠治療7 d、14 d創面肉芽組織IL-1β、IL-2及PGE2表達升高(P<0.05)；與模型組比較，肛門洗劑組、陽性對照組大鼠治療7 d、14 d創面肉芽組織IL-1β、IL-2及PGE2表達降低(P<0.05)。

表3 大鼠肉芽組織IL-1β、IL-2及PGE2含量變化比較

注:與本組7 d時比較：*P<0.05；與正常組同時間點比較：#P<0.05；與模型組同時間點比較：▲P<0.05

2.4 各組大鼠創面肉芽組織FGF-1、FGF-2、FGF-6表達情況

圖1表4顯示，與正常組比較，模型組大鼠治療7、14 d肉芽組織FGF-1、FGF-2及FGF-6表達降低(P<0.05)；與模型組比較，肛門洗劑組、陽性對照組大鼠7、14 d肉芽組織FGF-1、FGF-2及FGF-6表達升高(P<0.05)。

表4 大鼠創口肉芽組織FGF-1、FGF-2、FGF-6表達變化比較

注:與本組7 d時比較：*P<0.05；與正常組同時間點比較：#P<0.05；與模型組同時間點比較：▲P<0.05

注：A.正常組；B.模型組；C.肛門洗劑組；D.陽性對照組圖1 大鼠創口肉芽組織FGF-1、FGF-2、FGF-6表達比較

3 討論

中醫認為，肛瘺病機多為肛癰潰后余毒未盡，結滯不散；或臟腑素虛，復感邪毒，氣血壅結，肉腐成膿。因此，清熱燥濕、補氣化瘀的原則應貫穿肛瘺術后治療的始終。肛門洗劑由五倍子、苦參、明礬、樸硝、桑寄生、荊芥碳、黃柏、白及、月石、百部等10味中藥組成，方中重用五倍子收濕斂瘡，苦參瀉火療創，合而為君；百部、明礬、黃柏協同增強苦參殺蟲止癢功效，又燥濕清熱；五倍子佐以荊芥炭、白及共行止血止癢之功；桑寄生、白及、樸硝聯合可補益內虛的同時可生肌消腫，加速創面愈合。本研究顯示，肛門洗劑可是肛瘺模型大鼠創面加速愈合，創口血流量、毛細血管數量明顯升高，說明肛門洗劑可能通過某些機制增加創口毛細血管數量，給局部創面愈合提供足夠血液，保障恢復創面的物質基礎，增加創口愈合速度。

炎癥與創口血運是影響肛瘺創面愈合的重要因素[11-12]，VEGF是目前已知的主要血管生長因子，HIF-1被認為是低氧條件時形成毛細血管的主要效能物質，并且HIF-1積累直接上調重要的促血管化因子VEGF[13-15]。近期研究發現，PLGF對微血管內皮細胞具有較強的促增殖作用，還可促進單核細胞及內皮細胞的游走，并增加內皮細胞的通透性[16]。Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ已被公認均參與創傷后病理性血管生成，并且在修復過程中起關鍵作用[17-18]。IL-lβ在急性炎癥中起重要作用，它可激活內皮細胞或巨噬細胞的產生，可活化中性粒細胞，啟動炎癥級聯反應[19]。IL-2又稱T細胞生長因子，能夠活化T細胞，促進細胞因子產生，促進B細胞增殖和分泌抗體，激活巨噬細胞[20]。PGE2作為重要的炎性介質，可以促進白細胞趨化，在傷害性刺激的局部迅速產生，并激活周圍感覺神經末梢疼痛受體，強化痛感[21]。本研究發現，肛瘺模型大鼠創口肉芽組織VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ及Ang-Ⅱ表達降低，IL-1β、IL-2及PGE2表達升高，而經肛門洗劑治療后上述血管生成相關因子及炎癥因子表達均明顯改善，說明肛門洗劑一方面可能通過降低炎癥相關因子表達，減輕創面的充血與滲出，并可能通過降低PGE2表達起到一定的鎮痛功效；另一方面，降低炎癥因子表達后，減少殺傷和包圍因子分泌，降低組織破壞程度，并促進血管生長相關因子的表達，加快血運重建，為組織修復階段提供營養物質保障，從而達到加速創口愈合的作用。

為深入研究肛門洗劑促進肛瘺模型大鼠創口其他深層相關機制。本研究對創口新生肉芽組中FGF家族蛋白進行檢測。FGF-1是第一個被確認的血管生長因子，可在細胞內進行重分部并分泌到細胞外與多種蛋白復合體進行裝配，起到生成血管的作用[22]。FGF-2廣泛存在于機體組織內，具有強烈的刺激細胞分裂增殖作用，對創面的修復起重要作用[23]。FGF-6在所有的肌源性組織中都有表達，Armand等通過研究發現，FGF-6既可刺激成肌細胞增殖、遷移，又可促進肌肉分化、肥大，對創口組織肌肉修復起重要作用[24]。結果顯示，肛瘺模型大鼠創口肉芽組織FGF-1、FGF-2及FGF-6表達均下降，而肛門洗劑治療后FGF蛋白表達回升，說明當出現創口時，可能由于炎癥反應強烈，FGF家族蛋白表達被抑制，肛門洗劑則可通過影響FGF-1、FGF-2加速刺激血管內皮細胞分裂、增殖、排列，從另一角度說明肛門洗劑可促進肛瘺創口血管再生的機制；而肛門洗劑促進FGF-6的表達，則從肌肉再生角度證實肛門洗劑確有直接促進肌細胞增殖、加速創口愈合的作用。

綜上所述，肛門洗劑提高肛瘺模型大鼠創口愈合率、創面局部血流量，其機制可能與降低創口新生肉芽組織炎癥相關因子IL-1β、IL-2及PGE2表達，并提高血管生長相關因子VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表達及FGF家族蛋白有關，為臨床應用肛門洗劑治療肛瘺補充可靠的科學依據，同時為進一步探索肛門洗劑相關藥效奠定基礎。