光動力對瘢痕疙瘩的抑制效果研究

游傳華，王一賀，陸雪飛

（1.海南醫學院第一附屬醫院 整形美容外科，海南 海口，570102；2.海南醫學院第一附屬醫院 麻醉科，海南 海口，570102）

瘢痕疙瘩是臨床上常見的皮膚組織的良性纖維增生性疾病，是一種以成纖維細胞的增殖和細胞外基質大量堆積為主要特征的疾病[1]。目前，臨床治療方法多種多樣，例如手術切除，藥物注射，激光，放療，物理治療等等，但復發率較高，總體療效不滿意[2]，仍需要尋求一種療效確切、不良反應率和復發率低的治療方法。我們采用氨基酮戊酸光動力療法(ALA—PDT)對瘢痕疙瘩模型進行試驗研究，取得一定效果，報道如下：

1 實驗對象與材料

1.1 實驗動物

成年健康裸鼠15只。

1.2 試劑與儀器

光敏劑：外用鹽酸氨酮戊酸（5-ALA，商品名艾拉，上海復旦張江生物醫藥股份有限公司，國藥準字H20070027）

激光設備：光動力治療儀（武漢亞格光電技術有限公司，型號LED-EB）

2 試驗方法

2.1 動物瘢痕模型建立

瘢痕疙瘩來源：患者外傷后1～2 年內形成的瘢痕疙瘩，未使用任何干預治療，經手術切除，病理檢查證實，患者知情同意。

瘢痕模型建立：消毒環境下，去除瘢痕疙瘩表皮及基底部分正常組織，依次以1.0cm內徑環鉆和手術刀切割，形成直徑1.0cm，高度0.5cm的圓柱形瘢痕疙瘩顆粒。在裸鼠背部兩側間隔中線1.5cm處分別作兩條縱行約1.5cm切口，深度達鼠背肌筋膜表面，創周稍作分離，將瘢痕疙瘩顆粒埋置于皮下，縫合2-3針。每只裸鼠背側埋置4個瘢痕疙瘩，此后可形成15周～20周穩定的病理性瘢痕[3]。

2.2 實驗動物分組

將15只裸鼠由1～15依次編號，隨機分為實驗組1、實驗組2和對照組三組，共計60處瘢痕疙瘩，每組5只20處瘢痕疙瘩。

2.3 試驗方法

分別于第4、8、12周進行實驗，實驗組1裸鼠瘢痕疙瘩以棉片濕敷濃度10%氨基酮戊酸溶液30分鐘，實驗組2濕敷濃度20%氨基酮戊酸溶液30分鐘，對照組濕敷生理鹽水棉片，隨后均采用輸出波長635nm的連續波激光照射20 min，照射功率密度100J/cm2，光斑直徑1cm。

2.4 標本采集

于第6、10、14周選擇三組15只裸鼠，每只切取1處背部相同部位的瘢痕疙瘩及周圍部分正常皮膚，切取深度為表皮至肌筋膜表面，切取后裸鼠背創面縫合消毒處理。

2.5 指標檢測

2.5.1 外觀及鏡下觀

2.5.2 瘢痕指數 切取的瘢痕疙瘩剔除周圍脂肪和肌肉組織，自表皮至基底由正中縱行切開成兩部分，一部分4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，5μm厚度切片，HE染色后置于低倍光鏡下檢測，測量瘢痕組織凸起最高點至肌筋膜表面厚度（H1），周圍正常組織表皮面至肌筋膜厚度（H2），計算瘢痕指數HI（HI=H1/H2）。

2.5.3 成纖維細胞數量（NA） Masson染色切片低倍光鏡下檢測，每張切片隨機選取5個視野，利用圖像分析系統，統計藍染的膠原纖維數量,結果取均數。

2.5.5 Western blot檢測 定量瘢痕標本粉碎研磨，取各組勻漿胰酶消化洗滌離心，細胞沉淀加入裂解液提取蛋白。經配膠、泡膜、轉膜、封閉、顯影后拍照留存，以圖像分析軟件Image j采集數據并通過Graph pad 6.0分析數據。

2.6 統計學方法

實驗結果以均數±標準差表示，采用spss17.0統計軟件分析，組間采用t檢驗和重復測量的方差分析。P＜0.05表示有顯著差異。

3 結 果

3.1 外觀及鏡下觀

第6周三組模型外觀差異不明顯，第9周~10周后，實驗組2瘢痕萎縮情況明顯優于觀察組，也優于實驗組1，硬度及充血狀況均有所改善。電鏡下可見實驗組細胞核膜萎縮，漿內存在大量空泡，線粒體數量減少，體積增大；對照組細胞核膜平整光滑，線粒體豐富。

3.2 瘢痕指數和成纖維細胞數量

各組數據顯示，經ALAL-PDT治療1次治療后，瘢痕指數（表1）和成纖維細胞數量（表2）雖有所下降，但不顯著（P＞0.05）；自2、3次治療，對照組2瘢痕組織瘢痕指數、成纖維細胞數量顯著低于對照組，實驗組1、2間也有差異，各組間差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 瘢痕指數（n=15）

表2 瘢痕組織成纖維細胞數量（n=15）

3.3 TG-β1 lOD值

三組中TGF-β1表達均為陽性，對照組陽性染色顆粒的數目、染色強度、密集程度均明顯高于實驗組（表3），組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，表明實驗組治療后瘢痕疙瘩TGF-β1顯著降低。

表3 瘢痕組織TGF-β1 IOD值（n=15）

3.4 Western blot檢測

通過檢測α-SMA在三組細胞中均有表達，其中對照組表達較高，實驗組2表達量最低，各組件對比均有差異，實驗組2與對照組顯著差異。

4 討 論

瘢痕疙瘩主要表現為成纖維細胞紊亂和膠原纖維過度增生[5]，呈現失代償、無調控性生長，普通手術切除往往造成新損傷，修復機制啟動，一定條件下成纖維細胞新一輪增殖并重新生成瘢痕疙瘩。如何控制成纖維細胞生物合成和增殖、誘導成纖維細胞凋亡，是瘢痕疙瘩生長形成抑制的關鍵。

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩植入裸鼠體內能在約20周內保持其原有的組織學結構特征[6]，建立裸鼠瘢痕疙瘩模型是可行的，通過PDT治療后瘢痕相關指標分析，可以推斷出PDT對瘢痕疙瘩的可能作用機制。

瘢痕組織細胞代謝較其他組織旺盛，對光敏劑的吸收也高于其他組織，這種特異性作用使得瘢痕可作為光敏劑靶細胞。ALA外敷30分鐘后部分透皮吸收，在靶細胞內轉換成原卟啉IX(PpIX),經635nm波長激光照射后激發，PpIX發生Ⅰ、Ⅱ型光動力反應，從單重態系間激發到三重態，繼而形成羥自由基和單態氧（1O2），這兩種產物造成自由基鏈式反應和氧化損傷[7]，瘢痕疙瘩中成纖維細胞占據吸收光敏劑的主導地位，損傷直接誘導成纖維細胞凋亡，造成瘢痕疙瘩的萎縮，達到治療的目的。

本研究中，治療后2周瘢痕厚度即開始降低，微血管數量及成纖維細胞數量均減少，鏡下膠原纖維排列較規則有序，表明在治療早期瘢痕增生已得到抑制，這可能就是由氧化損傷的毒性反應所引起的。而在治療后期治療組瘢痕退縮程度仍遠快于對照組，則表明可能并非單一由氧化反應誘發細胞凋亡引起作用。皮膚真皮組織病理分類為上皮組織，瘢痕疙瘩為間葉組織，瘢痕增生過程中涉及上皮組織到間葉組織的轉化過程，有研究表明TGF-β1可促進瘢痕疙瘩表皮細胞發生上皮-間質轉化（EMT）[8]，而α-SMA是上皮間質轉化過程中成纖維細胞的特異性表達蛋白，也是使TGF-β1/Smad信號通路發生作用的重要分子蛋白[9]。本實驗中，實驗組TGF-β1及α-SMA顯著低于對照組，通過調控上游信號，減少上皮組織分泌細胞因子及趨化因子，誘導降低間葉組織特異性蛋白α-SMA、波形蛋白等表達，從而抑制EMT的過程，阻止瘢痕化進程。據此分析，ALA-PDT能夠破壞成纖維細胞合成進程，抑制成纖維細胞形成、增殖及膠原等胞外基質產生，最終抑制瘢痕增殖。

綜上，本實驗研究表明ALA-PDT作用下瘢痕疙瘩中成纖維細胞數量降低，瘢痕增生明顯抑制，20%ALA濃度下作用更為明顯。其作用機制可能與①激光能量作用造成部分膠原分解；②光敏劑分解形成單線態氧的細胞毒作用，誘發成纖維細胞凋亡；③降低TGF-β1與α-SMA含量，調控減少瘢痕疙瘩表皮細胞發生上皮-間質轉化，減輕成纖維細胞合成和胞外基質沉積有關，但還需要開展進一步實驗研究。