蝦青素對小鼠結腸急性氧化損傷的保護作用

張子琪，朱凌羽，劉惠麟，李若楠，郎伍營，吳 旻，蘭海楠，鄭 鑫

（吉林農業大學動物科學技術學院，吉林長春 130118）

腸道是機體對營養物質消化吸收的主要器官，也是機體內最大的免疫器官。受環境及飲食因素影響，動物腸道尤其是在低齡家畜中，極易出現腸道炎癥而導致疾病的發生。炎癥性腸病包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎，是一組非特異性腸道慢性炎癥疾病，可增加結直腸癌發生的風險[1]，它是由各種環境因素引起，如胃腸道感染、非甾體抗炎藥物使用或其他環境毒素等[2]。隨著生活水平的提高，市場對于畜產品的需求量越來越大，亟待解決的問題之一就是用天然的飼料添加劑徹底替換抗生素類藥物，使畜禽健康成長的同時可自身抵御外界疾病。

蝦青素（Astaxanthin，ATX）是一種紅橙色的葉黃素類胡蘿卜素，具有強抗氧化性。雨生紅球藻是天然蝦青素的豐富來源，鮭科魚類、蝦類等甲殼類生物體內也含有蝦青素[3]。許多研究表明，蝦青素具有抗氧化、抗炎和抗癌特性等多種生物活性，可降低人類及動物多種疾病的發生[4-5]，現已被美國食品藥物管理局和歐盟委員會批準作為食品添加劑。目前關于蝦青素的研究大都是單一、孤立地研究其某一特性，但炎癥反應與氧化應激有著千絲萬縷的聯系。為此，本試驗以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導小鼠發生炎癥反應，建立急性小鼠結腸炎癥模型，研究蝦青素對炎癥因子水平和氧化損傷程度的影響，來說明蝦青素對小鼠急性結腸炎癥反應的抑制作用和對結腸氧化損傷的保護作用，并通過NF-κB 信號通路探討兩者之間的關系，為蝦青素作為食品和飼料添加劑的使用以及其在炎癥性腸病防治中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼養管理 隨機將6 周齡、體重均為（18±1）g 的32 只雄性ICR 小鼠（購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司）分為4 組（對照組、蝦青素組、LPS 組和蝦青素保護組），每組8 只。在LPS 注射前連續15 d，對照組與LPS 組小鼠灌胃橄欖油，蝦青素組與蝦青素保護組灌胃50 mg/kg 蝦青素，蝦青素（雅仕達生物技術有限公司，純度：2%）溶于橄欖油中。小鼠在第15 天灌胃后禁食12 h，之后LPS 組和蝦青素保護組小鼠按1 mg/kg 劑量腹腔注射LPS，LPS 溶于無菌生理鹽水中。同時，對照組和蝦青素組注射等量無菌生理鹽水。

小鼠飼養在12 h 明暗交替循環、室溫（25±1）℃的無菌動物實驗室內，適應環境1 周后進行試驗。所有小鼠均飼喂標準小鼠日糧，在整個飼養期間保證小鼠自由攝食和飲水。

1.2 樣品采集 各組小鼠在LPS/生理鹽水腹腔注射3 h后，進行血液和結腸組織采集。采集血液：小鼠眼球采血，血液置于1.5 mL 離心管中，室溫下靜置30 min 以析出血清，4℃，3 500 r/min 離心15 min 分離血清，-20℃保存備用。結腸組織采集：頸椎脫臼處死小鼠，迅速自肛門上2 cm 處向上分離結腸6～8 cm，4% 多聚甲醛溶液固定，待做組織切片；其余腸組織置于生理鹽水中清洗，吸干水分后在液氮中速凍，之后置于-80℃冰箱中保存備用。

1.3 ELISA 檢測各組小鼠血清中炎性水平 根據ELISA檢測試劑盒（美國R&D System）說明書，分別檢測和計算各組小鼠血清中腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、 白 細 胞 介 素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）和髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）含量，每組設3 個重復并且每個樣本測3 個重復值。Thermo 酶標儀（上海賽默飛世爾）檢測。

1.4 Western blot 檢測各組小鼠結腸組織中p-NF-κB p65蛋白的相對表達量 取出凍存的腸段組織，用預冷的PBS 洗滌2 次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術有限公司），在冰上進行組織勻漿，12 000 r/min 4℃離心5 min，取上清液，BCA法測蛋白濃度。取20 g 總蛋白進行SDS-PAGE 電泳，電轉印至PVDF 膜上，用5%的BSA 封閉1 h，一抗為鼠源的p-NF-κB p65抗體（1∶1 000），兔源的β-actin 抗體（1∶5 000）（美國 CST），4℃孵育過夜。TBST 洗膜后分別加入相應的二抗∶HRP 標記的山羊抗鼠IgG（1∶3 000）和HRP 標記的山羊抗兔IgG（1∶3 000）（天津三箭生物技術有限公司），37℃孵育1 h 。TBST 洗膜后，凝膠成像儀（美國Bio-Rad）感光顯色，目的條帶用 Image J 進行灰度分析，用目的條帶灰度值比上內參（β-actin）條帶灰度值計算出蛋白相對表達量。

1.5 結腸組織中抗氧化指標測定 取部分結腸組織，用冰凍的生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重，剪碎后加入9 倍生理鹽水，在冰浴中機械勻漿成10%勻漿液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，按南京建成生物研究所有限公司相應的試劑盒說明操作測定結腸組織蛋白、丙二醛（MDA）含量與超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）等抗氧化酶活性。1 個酶活力單位（U）表示每分鐘轉化1 μmol 底物的酶量。

1.6 熒光定量PCR 檢測各組結腸組織中炎性因子及抗氧化酶mRNA 相對表達量 熒光定量PCR 檢測各組小鼠結腸組織中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、一氧化氮合酶（Induced Nitric Oxide Synthase，iNOS）、環氧合酶（cyclooxygenase-2，COX-2）和SOD、GSHPx、CAT 等抗氧化酶的mRNA 相對表達量。根據上海ExCell 公司RNA Lyzol 說明書提取各個腸段組織RNA，并測得所有樣品濃度和質量，OD260/280在1.8～2.0，可用于下一步試驗。然后按照美國Gene Copoeia 公司cDNA 逆轉錄試劑盒的步驟將RNA 反轉錄為cDNA。最后進行熒光定量PCR，采用20 μL 反應體系：SYBR（日本TaKaRa）10 μL，上、下游引物各1 μL、cDNA 模板2 μL，ddH2O 6 μL，在美國Bio-Rad 熒光定量PCR儀中按照95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，39 個循環進行PCR 反應，每次試驗均設置18S 作為內參，用2-ΔΔCt法計算炎性因子mRNA 的相對表達量。所用引物均由上海生工生物技術公司合成（表1）。

1.7 結腸組織病理學分析 將各組小鼠結腸用一系列濃度梯度的乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，常規脫蠟復水，經蘇木精- 伊紅（HE）染色，中性樹脂封片后光鏡檢查。

1.8 統計分析 試驗數據經Microsoft Excel 2010 整理，利用SPSS 19.0 軟件進行統計分析，結果以平均值±標準差表示，數據采用單因素方差分析，Duncan's 法進行多重比較，P＜0.05 為差異顯著。

2 結 果

2.1 結腸組織病理學觀察 如圖1 所示，對照組與蝦青素組結腸結構正常；LPS 組結腸損傷嚴重，出現黏膜糜爛、水腫，黏膜層和固有層炎性細胞浸潤增加；蝦青素保護組黏膜受損較輕，炎細胞浸潤較少，極少出現絨毛頂端破損，絨毛狀態均勻完整。提示急性結腸炎癥模型建立成功，蝦青素可預防急性炎癥帶來的結腸形態損傷。

表1 熒光定量PCR 引物序列表

圖1 光鏡下各組小鼠結腸黏膜組織HE 染色（×100）

2.2 蝦青素對LPS 誘導的小鼠血液炎性因子的影響 由表2 可 知，LPS 組 血 清 中 炎 性 因 子TNF-α、IL-6、IL-1β 及MPO 的分泌量高于對照組、蝦青素組和蝦青素保護組（P＜0.05），提示蝦青素降低了LPS 誘導的血清炎性因子的分泌量，蝦青素對細胞炎癥因子的分泌有一定抑制作用。

2.3 蝦青素對小鼠結腸組織氧化水平的影響 由表3 可知，與對照組相比，LPS 組小鼠結腸組織MDA 含量升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px、CAT 活性降低（P＜0.05）；與LPS 組相比，蝦青素保護組小鼠結腸組織MDA 含量降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px、CAT 活性升高（P＜0.05）。提示LPS 組小鼠結腸的抗氧化水平顯著降低，氧化損傷明顯，而蝦青素保護能明顯改善小鼠結腸抗氧化能力，降低結腸氧化損傷。

2.4 蝦青素對小鼠結腸組織炎性因子及抗氧化酶mRNA相對表達量的影響 如圖2 顯示，與LPS 組相比，蝦青素保護組可降低炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 和炎癥相關誘導型iNOS、COX-2 的mRNA 相對表達量（P＜0.05），提高抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT 的mRNA 相對表達量（P＜0.05）。表明蝦青素可抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、COX-2 等基因的轉錄水平，同時提高抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT 等mRNA 水平，進而緩解結腸組織的急性損傷。

2.5 蝦青素對小鼠結腸p-NF-κB p65 蛋白表達的影響如圖3 所示，LPS 組結腸組織中p-NF-κB p65 蛋白表達量高于對照組和蝦青素保護組（P＜0.05）。由此推測，蝦青素對LPS 誘導的小鼠急性結腸炎癥的保護作用可能是通過抑制NF-κB p65 蛋白的活化來實現的。

表2 蝦青素對小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、MPO 的影響

表3 蝦青素對小鼠結腸組織SOD、GSH-Px、CAT、MDA 的影響

圖2 蝦青素對LPS 誘導的小鼠結腸炎性因子和抗氧化酶mRNA 相對表達量的影響

圖3 蝦青素對LPS 誘導的小鼠腸道p-NF-κB p65 蛋白表達的影響

3 討 論

炎癥是通過消除有害刺激來對機體進行自身保護的過程，通常是有益的，但如果持續較長時間，會導致宿主患各種慢性疾病，進而引發癌癥[6]。炎癥在激活腫瘤形成中至關重要，并且炎癥誘導的細胞因子（如TNF-α和IL-1β）可促進腫瘤的形成。另外，參與腫瘤起始、促進和轉移的幾種基因（如COX-2、MMP-9、iNOS、TNF-α、IL-8 等）均由NF-κB 編碼和調節[7]，其與人和小鼠腫瘤的發生和進展相關[8]。此外，許多致癌基因和致癌物質也會引起NF-κB 的活化，而具有已知化學預防特性的化學物質可以抑制NF-κB 的活化。研究表明，蝦青素通過誘導細胞凋亡和調節NF-κB、COX-2、MMPs-2/9、Akt、ERK-2 的表達，對二甲基肼誘導的大鼠結腸癌顯現出抗癌作用[9]。另外，選擇性COX-2抑制劑可降低NF-κB 蛋白的表達，進而緩解大鼠結腸病變[10]。綜上說明蝦青素可通過調節相關基因來緩解炎癥反應。

LPS 又稱內毒素，是革蘭陰性菌細胞壁外膜中的主要成分，可引起全身炎癥反應綜合征，增強許多炎性因子（如TNF-α、IL-6 和IL-1β 等）的分泌和表達，因此可通過檢測這些因子的分泌和表達量來衡量炎癥的嚴重程度[11]。給小鼠注射LPS 后，巨噬細胞和嗜中性粒細胞釋放炎性因子，最初的促炎性細胞因子TNF-α 和IL-6 被激活，刺激IL-1β、IL-8 等下游細胞因子表達，它們都在細胞因子級聯中起到重要作用[12]。許多體內和體外研究顯示，蝦青素給藥減少了TNF-α、IL-1β 和IL-6 的釋放并可通過抑制膿毒癥大鼠模型中的炎癥來保護多器官免受損傷[13-14]。再者，研究表明添加蝦青素的飲食可以降低黃曲霉毒素B1誘導的肝臟組織中MPO水平升高[15]。本研究結果表明，蝦青素顯著降低LPS誘導的急性結腸炎小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 和MPO 的分泌，可下調組織中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β 及炎癥相關酶iNOS、COX-2 的mRNA 水平并可抑制NF-κB p65 蛋白的活化。

氧化應激是由于氧化與抗氧化系統之間的不平衡，導致機體內產生過量ROS。過量ROS 可能導致肺血管內皮的炎癥損傷[16]。機體通過抗氧化酶（如SOD、GSH-Px、CAT）以及非酶抗氧化劑（如維生素E、β-胡蘿卜素等）來調節機體的氧化還原水平[17]。氧化還原平衡被打破后，一些與自由基代謝有關的抗氧化酶和保護細胞免受氧化應激的抗氧化劑通常被耗盡。另外，MDA 是過量ROS 誘導的脂質過氧化產物，廣泛用作氧化應激發生的標志物[18]。本研究結果顯示，蝦青素可顯著提高LPS 誘導的小鼠急性結腸炎癥組織中抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px 的活性及其基因的表達，同時顯著降低MDA 含量，并且通過HE 染色從病理形態學角度表明了蝦青素對急性結腸炎的預防作用。值得注意的是，在對急性肺損傷的研究中發現蝦青素能夠下調NF-κB p65 的表達，緩解氧化應激并抑制炎癥[14]。此外，NF-κB、IL-6、IL-8、IFN-γ 等細胞因子能刺激炎性細胞誘導iNOS 蛋白表達上調產生大量NO，參與炎癥反應[19]。說明炎癥反應和氧化應激的發生很有可能是通過NF-κB信號通路相連。研究表明，蝦青素具有比角黃素、β-胡蘿卜素或玉米黃質高十倍的抗氧化活性，它可以減緩氧化應激和硝化應激，保護細胞和組織免受自由基損傷[20]。人體血液檢測的結果顯示，每天補充蝦青素可以下調炎癥細胞因子（如IL-6 和IFN-γ）的水平，并抑制活性氧和活性氮的產生[21]。因此，蝦青素通過NF-κB 信號通路調節的一系列機制有可能首先來自于其強大的抗氧化性。

盡管許多研究表明蝦青素有很強的抗炎和抗氧化性，但它在炎癥性腸病中確切的作用機制仍需進一步探索。可通過NF-κB 這一條關鍵的信號通路研究其與炎癥、氧化應激、細胞凋亡壞死等機制。另外，蝦青素對結腸的保護作用也可能來自于其對腸道功能完整性的保護和對腸道菌群環境的改善。蝦青素現已被用作保健品或食品添加劑，這些都預示著服用蝦青素是一種預防和治療炎癥性腸病的新方法。由于本研究僅基于動物試驗，尚需對其作用機制進行深入研究并開展前瞻性臨床研究來評估蝦青素是否適用于急性結腸炎的臨床治療。

4 結 論

本研究表明，蝦青素可以通過抑制NF-κB p65 的活化降低血液和結腸組織中炎癥水平，提高結腸中抗氧化能力，從而減輕LPS 誘導的急性結腸損傷；此外，蝦青素還可維持腸道黏膜結構的完整性，其潛在的作用機制可能受益于其強大的抗氧化和抗炎活性。蝦青素作為食品和飼料添加劑可能開辟出預防和治療炎癥性腸病的新途徑。