BMAL1 對小鼠睪丸間質細胞凋亡的影響

丁 赫，郭樂薇，徐高青，王 軍，呂文發

（吉林農業大學動物科技學院，吉林省反芻動物繁育生物技術與健康養殖工程實驗室，吉林長春130118）

生物鐘通過外部信號和內部時間系統之間的協調，調控著機體的代謝、激素水平、體溫、睡眠等生化和生理過程。生物鐘是一種基于轉錄翻譯的反饋回路，使基因和蛋白以24 h 為周期循環表達，并且當外界晝夜交替的現象消失時，這樣的節律一直存在[1-3]。在生物鐘系統中，BMAL1 和CLOCK 是核心的生物鐘基因，它們通過與目的基因啟動子的特異元件E-boxes 結合，調控基因的轉錄[4-5]。晝夜節律機制被破壞影響著機體的生理狀況，可能導致肥胖、衰老、哮喘、癌癥、神經系統紊亂等多種疾病[6-9]。哺乳動物的睪丸主要包括支持細胞和間質細胞2 種細胞，具有產生精子和雄激素的重要作用。有研究表明，在小鼠睪丸間質細胞中存在BMAL1 蛋白的表達，并且呈現明顯的晝夜節律規律[10]，但BMAL1 對小鼠睪丸間質細胞凋亡的影響仍不清楚。本實驗利用qRT-PCR、Western Blot 和流式細胞技術研究敲減BMAL1 對小鼠睪丸間質細胞凋亡水平及凋亡相關蛋白（BAX 和BCL-2）表達的影響，明確BMAL1對小鼠睪丸間質細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 BMAL1 siRNA 細胞轉染 根據說明書操作，將離心管3 000 r/min 離心1 min，取125 μL DEPC 水加入到離心管中，配制成20 μmol/L 溶液。將小鼠睪丸間質細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，CL-0234）傳代至6 孔板中，1×105個/孔，37℃ 5% CO2培養箱中培養細胞24 h，待細胞完全貼壁，細胞生長到80%～90%時開始轉染。10 μL LipofectamineTM2000 加入到250 μL 普通培養液中，輕輕混勻，室溫孵育5 min；9 μL BMAL1 siRNA 和BMAL1 siRNA NC（Negative Control），siRNA 序列見表1，分別加入到250 μL 的普通培養液中，輕輕混勻，室溫孵育5 min。將前兩步的預混液混合，室溫孵育20 min。棄去細胞培養液，使用無雙抗的PBS 清洗2～3 次，添加1.5 mL 無血清、無雙抗的普通細胞培養液，同時將孵育好的混合液分別添加至6 孔板的細胞培養液中，輕輕混勻，放到37℃ 5% CO2培養箱中繼續培養。6 孔板中細胞培養6 h 后，添加200 μL血清至培養液中，繼續培養18～42 h，提取RNA 和蛋白，進行檢測。

1.2 流式細胞術 將已轉染處理的細胞棄上清，用PBS洗2～3 次，使用0.25%的胰酶消化細胞，完全培養液終止消化，1 000 r/min 離心5 min 棄上清，并用PBS 清洗2～3 次，收集細胞。使用凋亡檢測試劑盒FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I（BD），10X Annexin V BindingBuffer 與蒸餾水1∶9 配制1×Binding Buffer，向裝有細胞沉淀的管中加入200 μL 1×Binding Buffer，每管中分別 加 入5 μL FITC Annexin V 和5 μL Propidium Iodide(PI) ，并設立3 組對照：空白不染色組、PI 單染組和FITC 單染組，輕柔混勻后室溫避光孵育15 min。結束后，再加入200 μL 1×Binding Buffer，過濾網至流式管中，立即上機檢測。

表1 BMAL1 siRNA 序列

1.3 qRT-PCR 采 用RNAiso Plus（TaKaRa） 提 取 小鼠睪丸間質細胞的總RNA，并反轉錄為cDNA，用于qRT-PCR 實驗，根據TaKaRa 的反轉錄試劑盒要求，利用RNA 的濃度值計算反轉錄20 μL cDNA 所需的RNA量。本實驗所需的基因引物序列見表2。引物由上海生工生物技術有限公司設計及合成，并利用PCR 儀進行引物驗證，摸索引物的最適反應條件。利用熒光定量PCR 儀 對BMAL1 siRNA 組 和BMAL1 siRNA NC組進行相關基因的分析。反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL、Forward primer 0.8 μL（0.4 μmol/L）、Reverse primer 0.8 μL（0.4 μmol/L）、ROX reference Dye Ⅱ0.4 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 至 20 μL。反應條件：95℃ 預變性30 s；95℃ 變性5 s，40 個循環；56（59）℃退火34 s，擴增40 個循環。運用 2－△△Ct方法進行數據分析。

表2 基因引物合成信息

1.4 Western Blot 根據蛋白大小分別配制10% 和15%聚丙烯酰胺凝膠，BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術公司）測定蛋白濃度，上樣20 μg/ 孔。80 V電壓電泳至分離膠，變為160 V 電壓電泳至結束。采用半干轉方法轉膜，轉膜條件0.12 A 28 min，將目的蛋白轉印到硝酸纖維素膜（NC 膜）上。采用封閉液封閉1.5 h，一抗（1∶1 000）BMAL1（CST，14020S）、BAX（abclonal，A12009）和BCL-2（abclonal，A11025），4℃孵育過夜，TBST 洗3 次，每次5 min 。孵育二抗（1∶10 000），室溫1 h，TBST 洗3 次，每次5 min 。最后用ECL 發光液顯影，用Tanon Gis 軟件進行灰度值分析。

1.5 統計分析 采用SPSS17.5 軟件進行t 檢驗，比較組間差異性，數據用平均值± 標準差表示，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。使用GraphPad Prism 5 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 BMAL1 siRNA 驗證 如圖1-A 所示，與NC 組相比，3 組siRNA 均能降低小鼠睪丸間質細胞內BMAL1 的表達（P＜0.01），干擾效率在30%～40%。為了提高siRNA 干擾效率，采用混合siRNA 干擾策略[11]，即siRNA546 ∶siRNA934∶siRNA1057=1∶1∶1， 如 圖1-B 顯 示， 混 合siRNA 干擾能夠提高干擾效率（50%～60%），用于后續的實驗處理。Western Blot 結果顯示（圖1-C），與NC組相比，siRNA 干擾組BMAL1 蛋白表達量下降（P＜0.05）。

2.2 細胞凋亡水平檢測結果 如圖2 所示， BMAL1 表達下降時，與NC 組相比，凋亡水平升高（P＜0.05）。

2.3 qRT-PCR 檢測凋亡相關基因 如圖3 所示，在BMAL1 基因被干擾后，促凋亡基因BAX 上升（P＜0.01），抑凋亡基因BCL-2 下降（P＜0.01）。這些結果表明，敲減BMAL1 基因表達促進小鼠睪丸間質細胞凋亡。

2.4 Western Blot 檢測凋亡相關蛋白 由圖4 可知，使用siRNA 干擾小鼠睪丸間質細胞中BMAL1 的蛋白表達，促凋亡基因BAX 蛋白表達量升高（P＜0.01），同時，抑凋亡相關基因BCL-2 的蛋白表達量下降（P＜0.05）。這些結果表明，當BMAL1 的蛋白表達量下降時，將會導致小鼠睪丸間質細胞凋亡相關蛋白水平升高，與qRT-PCR 結果一致。

3 討 論

已有研究發現，生物節律基因BMAL1 在睪丸組織中有表達，但是其對睪丸細胞凋亡的影響還不清楚[10]。本研究發現，通過敲減BMAL1 表達可促進小鼠睪丸間質細胞的凋亡且伴隨著促凋亡蛋白BAX 顯著上調，抑凋亡蛋白BCL-2 顯著下調，表明BMAL1 可抑制小鼠睪丸間質細胞凋亡。

圖1 BMAL1 siRNA 干擾效率驗證

圖2 BMAL1 siRNA 對睪丸間質細胞凋亡水平影響

圖3 干擾BMAL1 基因對凋亡相關基因表達的影響

圖4 干擾BMAL1 基因凋亡相關蛋白BAX 和BCL-2 的表達

晝夜節律調控著動物的生理生化過程，晝夜節律破壞會導致各種病理現象發生，尤其是對動物的生殖生理有著重要影響[6,12]。已有研究表明，生物節律基因BMAL1 在下丘腦、垂體和睪丸中均有表達，并發揮著重要功能[10,13-14]。為檢測BMAL1 對小鼠生殖能力的影響，Alvarez 等[15]通過敲除雄性小鼠和雌性小鼠的BMAL1 基因，發現2 只小鼠均不育，而且影響雄性小鼠血清中的睪酮濃度，說明BMAL1 基因被敲除后導致小鼠睪丸間質細胞存在缺陷，影響小鼠性腺發育和功能。已有多項研究發現，BMAL1 基因調控著細胞凋亡水平。Sun 等[16]通過敲減BMAL1 和CLOCK 的表達，發現生物節律基因能夠影響紫外線引發的人角質形成細胞（HKCs）的凋亡水平。在哺乳動物中，顆粒細胞與卵泡發育及卵巢功能密切相關。研究發現，抑制BMAL1 基因的表達能夠促進豬顆粒細胞凋亡，并且降低激素合成相關基因CYP11A1、CYP19A1 和STAR 基因的表達，影響顆粒細胞的生理功能[17]。在大鼠卵巢細胞的研究中，生物節律基因的改變同樣會影響卵泡的發育、黃體化和細胞凋亡[18]。同樣的，在HL-60 細胞系中，敲除BMAL1 基因，結果發現敲除組HL-60 細胞的細胞凋亡水平明顯高于對照組，說明敲除 BMAL1基因促進 HL-60 細胞的凋亡[19]。在小鼠骨髓細胞中生物鐘基因具有保護作用以防止細胞的凋亡[20]。已有研究發現，細胞凋亡的啟動與促凋亡基因BAX 及抑凋亡基因BCL-2 的比率有關，高表達的BCL-2 蛋白能夠與BAX 蛋白形成異二聚體，減少細胞死亡，而高濃度的BAX 蛋白會形成同二聚體，誘導細胞凋亡[21]。目前BMAL1 對凋亡相關蛋白BCL-2 和BAX 表達作用的報道極少，在人肝癌細胞系中使用siRNA 敲低BMAL1基因的表達，導致凋亡蛋白BAX 和Cleaved caspase 3顯著升高[22]。但有人發現另一個時鐘基因CLOCK 可能通過調節凋亡相關蛋白BAX 和BCL-2 調節細胞凋亡水平。Li 等[23]利用CLOCK shRNA 轉染小鼠胚胎干細胞，流式細胞術發現CLOCK 低表達導致細胞凋亡水平升高，Western Blot 發現促凋亡基因BAX 和Cleaved caspase-3 蛋白表達顯著增加，抑凋亡基因BCL-2 的蛋白表達顯著下降。以上研究表明，生物節律基因BMAL1 能降低細胞的凋亡水平。

4 結 論

本研究結果表明，敲減BMAL1 可導致小鼠睪丸間質細胞凋亡水平上升及凋亡相關基因BAX 及BCL-2 的表達量上升，提示BMAL1 抑制小鼠睪丸間質細胞凋亡。