冠心病患者血清微小核糖核酸-335、潛在轉化生長因子結合蛋白2的表達及意義

吳英鳳，王林，楊麗

(1天津海濱人民醫院，天津300280；2天津市胸科醫院)

冠心病病情較復雜，近年來，我國冠心病發病率呈逐年升高趨勢[1]。目前，冠狀動脈(冠脈)造影是國內外公認診斷冠心病的金標準，但該診斷方式會對患者造成一定程度的創傷，尤其是對于自身條件較差及對造影劑過敏患者存在一定局限性[2]。研究發現，微小RNA廣泛參與細胞的凋亡、分化等過程，對腫瘤、糖尿病、感染及動脈粥樣硬化等病理過程有一定的調控作用，有望成為冠心病的診斷指標之一[3]。潛在轉化生長因子結合蛋白2(LTBP-2)作為細胞外基質糖蛋白之一，在機體動脈損傷、細胞黏附及彈性纖維凝聚等過程中發揮重要作用。2016年6月～2018年6月，我們觀察了冠心病患者血清微小核糖核酸-335(miR-335)、LTBP-2的表達變化，并探討二者與冠心病嚴重程度的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 以2016年6月～2018年6月天津海濱人民醫院收治的冠心病患者102例為研究對象。納入標準：①符合冠心病的診斷標準[4]，經冠脈造影證實至少1支血管狹窄≥50%；②患者臨床資料完整，入院前未接受任何相關治療；③年齡≥18歲。排除標準：①伴有血液、免疫系統疾病和感染性疾病者；②合并嚴重肝、腎功能障礙者；③有精神疾病的意識不清、無法配合本研究者。將其按照疾病類型分為穩定型心絞痛(SAP)36例(SAP組)、不穩定型心絞痛(UAP)32例(UAP組)、急性心肌梗死(AMI)34例(AMI組)。SAP組男21例、女15例，年齡32～77(58.10±5.23)歲。UAP組男20例、女12例，年齡33～75(58.02±5.18)歲。AMI組男22例、女12例，年齡38～73(57.85±5.25)歲。對照組男27例、女13例，年齡37～74(57.94±5.20)歲。參照文獻[5]方法，根據Gensini總積分將冠心病患者分為輕度病變組37例(Gensini總積分在0～26.0分)、中度病變組40例(Gensini總積分在26.1～51.4分)、重度病變組25例(Gensini總積分>51.4分)。選取同期40例冠脈造影診斷為非CHD患者為對照組，排除標準同入選的冠心病患者。各組性別、年齡比較差異無統計學意義(P均>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫院倫理委員會批準,各組研究對象對本研究均知情同意。

1.2 血壓及血生化指標檢測方法 各組研究對象入院后測量血壓，采集2份清晨空腹靜脈血4 mL，取其中1份，采用AU5800全自動生化分析儀(美國Beckman公司)檢測空腹血糖、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。另外1份空腹靜脈血，3 000 r/min離心5 min，分離血清，采用酶聯免疫吸附法檢測血清LTBP-2水平，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行，相關試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3 血清miR-335、LTBP-2檢測方法 各組研究對象入院后采集清晨空腹靜脈血4 mL，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測血清miR-335表達：TRIzol法提取總RNA，試劑盒購自美國Qiagen公司。以反轉錄試劑盒獲取cDNA，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行，試劑盒購自美國ABI公司。將cDNA用以qRT-PCR反應模板，并將U6作為內參基因，進行miR-355表達檢測，miR-355正向引物5′-CTCCAGCTGTCAAGAGCAATAACGAA-3′，反向引物5′-TCCAGTCCCTCCGAGGT-3′；U6正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。其中qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，qRT-PCR反應體系： cDNA 1.0 μL，SYB Preimix Ex TaqTM10 μL， Primer 0.8 μL， RNase H2O 12.4 μL。qRT-PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40個循環。通過2-△△Ct法計算miR-335表達。

2 結果

2.1 四組血壓及血生化指標水平比較 對照組、SAP組、UAP組、AMI組收縮壓、舒張壓、空腹血糖、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表1。

表1 四組血壓及血生化指標水平比較

2.2 四組血清miR-335、LTBP-2水平比較 對照組、SAP組、UAP組、AMI組血清miR-335水平呈逐漸下降趨勢，而血清LTBP-2水平呈逐漸升高趨勢，單因素方差分析結果顯示，各組間差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 四組血清miR-335、LTBP-2水平比較

注：與對照組相比，#P<0.05；與SAP組相比，*P<0.05；與UAP組相比，△P<0.05。

2.3 不同病變程度冠心病患者血清miR-335、LTBP-2水平比較 輕度病變組、中度病變組、重度病變組血清miR-335水平呈逐漸下降趨勢，而血清LTBP-2水平呈逐漸升高趨勢，單因素方差分析結果顯示，各組間差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表3。

表3 不同病變程度冠心病患者血清miR-335、LTBP-2水平比較

注：與輕度病變組相比，#P<0.05；與中度病變組相比，*P<0.05。

2.4 冠心病患者病情嚴重程度與血清miR-335、LTBP-2的相關性 冠心病患者病變嚴重程度與血清miR-335水平呈負相關(r=-0.673，P<0.05)，而與LTBP-2水平呈正相關(r=0.705，P<0.05)。

3 討論

冠心病屬于臨床常見的心血管疾病之一，已成為全球范圍內嚴重危害人類生命健康安全的重大疾病。如不采取及時有效的治療，隨著病情的進展會導致UAP及AMI的發生，增加患者的死亡風險[6]。因此，早期正確對冠心病患者進行診斷，并對其病情進展進行有效監測，是降低患者潛在血管事件發生及改善預后的重要途徑[7]。miRNAs作為一種可特異性結合靶向mRNA的短序列非編碼RNA，參與了細胞增殖、分化、凋亡及腫瘤形成等生物學過程[8]。miR-335主要定位于人類染色體7q32.2上，已被證實參與人類胃癌、乳腺癌等多種腫瘤的發生發展。LTBP-2是近年來新發現的細胞外分泌蛋白，廣泛存在于人體心臟、肝臟以及肺臟中，其功能接近于原纖蛋白。LTBP-2參與多種疾病的發生發展[9]。研究表明，LTBP-2可通過調控轉化生長因子的活性起到穩定細胞外基質的作用。研究發現，LTBP-2在心肌纖維化中起重要作用[10，11]。然而，關于miR-335與LTBP-2在心血管疾病中的研究報道并不多見。

本研究結果表明，各組基線資料無統計學差異，排除其他因素對本研究結果的干擾，為后面的研究奠定可信度。而對照組、SAP組、UAP組、AMI組血清miR-335水平呈逐漸下降趨勢，而血清LTBP-2水平呈逐漸升高趨勢，且經單因素方差分析發現，各組間差異均有統計學意義。說明冠心病患者血清miR-335存在明顯低表達，而LTBP-2水平存在明顯高表達，提示上述兩項指標可能成為評估冠心病患者病情嚴重程度的有效指標[12]。另外，輕度病變組、中度病變組、重度病變組患者血清miR-335水平呈逐漸下降趨勢，而血清LTBP-2水平呈逐漸升高趨勢，提示隨著冠心病患者病情逐漸惡化，miR-335表達越低，而LTBP-2越高，臨床通過對上述兩項指標水平進行檢測，有助于判斷冠心病患者的病情嚴重程度。有研究表明，miR-335可負向調控鈣調蛋白，參與急性缺血性腦卒中的發生發展[13]。Lee等[14]通過探討miR-335對大鼠模型微血管內皮細胞凋亡的影響發現，miR-335可能在缺氧復氧過程中發揮關鍵調控作用，推測其可能成為缺血再灌注損傷的治療新靶點。筆者推測，miR-335可能通過與動脈粥樣硬化病變基因mRNA 3′端非編碼區結合，起到非特異性降解mRNA的作用，進而阻止冠狀動脈粥樣硬化病變的發生[15]。轉化生長因子β1(TGF-β1)由巨噬細胞分泌，在冠狀動脈粥樣硬化發生發展中起重要作用[16]。白媛媛等[17,18]研究發現，TGF-β1可通過ERK和PI3K信號通路促進心肌細胞中LTBP-2表達，后續納入133例呼吸困難患者進一步研究發現，LTBP-2對心力衰竭的診斷價值與N-末端腦鈉肽前體相當，有望成為臨床心血管疾病早期及預后的生物標志物，但其具體機制有待進一步研究證實。上述研究結果均為miR-335與LTBP-2成為冠心病的診斷指標提供了可能性。進一步經Pearson相關性分析發現，冠心病患者病變嚴重程度與血清miR-335水平呈負相關關系，而與LTBP-2水平呈正相關關系。提示血清miR-335、LTBP-2水平與冠心病患者病情嚴重程度相關，可隨著病情的變化而變化。臨床可通過聯合檢查miR-335與LTBP-2水平，從而有效反映冠心病患者的病情變化，進一步為臨床治療方案的制定提供參考依據，達到改善患者預后的目的。

綜上所述，冠心病患者血清miR-335水平降低，而LTBP-2水平升高;二者聯合檢測有助于患者病情程度的評估。