丙型肝炎病毒感染患者血清及PBMC中miR-122、miR-29b的表達(dá)

何雪琴，王靳琎，余飛，魏英，周青珍，向小衛(wèi)，桑明，陳琴華,2

(1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，湖北十堰 442000；2武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

丙型肝炎(丙肝)是嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病之一，易轉(zhuǎn)變?yōu)槁詽摲腥荆叶鄶?shù)患者可能發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，全世界范圍約有31.1%的肝癌病例由丙型肝炎病毒(HCV)感染所致[1～3]。丙肝起病隱匿，感染初期約80%患者無明顯癥狀，易漏診。目前診斷HCV感染的“金指標(biāo)”是HCV-RNA定量，但其與丙肝的嚴(yán)重程度并非絕對相關(guān)，多用于評估抗病毒的療效及判斷預(yù)后。微小RNA(miRNA)是一類參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的小分子RNA，參與調(diào)控機(jī)體的多種生理過程[4,5], 并參與病毒感染和腫瘤的發(fā)生發(fā)展等病理過程[6]。miR-122為肝臟中特異性表達(dá)的miRNA，占肝臟總miRNA的72%，對肝臟生理功能有重要調(diào)節(jié)作用，在HBV、HCV等嗜肝性病毒感染過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能[7]。miR-122可作為HCV感染早期診斷和預(yù)后判斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。2018年7月，我們檢測了HCV感染及HBV感染患者血清和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中miR-122和miR-29b表達(dá)，探討二者與HCV感染的關(guān)系，為丙肝的預(yù)防、診斷和治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選取2016年6月～2018年6月湖北省十堰市國藥東風(fēng)總醫(yī)院收治的HCV感染者16例(HCV組)，男10例、女6例，年齡(48±6)歲。HBV感染者30例(HBV組)，男15例、女15例，年齡(47±4)歲。同時(shí)感染HCV和HBV者12例(HCV+HBV組)，男8例、女4例，年齡(48±4)歲。三組均經(jīng)血清HCV-RNA、HBV-RNA定量檢測明確診斷。另納入30例查體健康志愿者作為對照組，男15例、女15例，年齡(45±4)歲。各組年齡、性別方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本研究通過我院倫理委員會批準(zhǔn)實(shí)施，所有研究對象知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 HCV-RNA及HBV-DNA定量檢測 按HCV-RNA定量和HBV-DNA定量檢測試劑說明書設(shè)置相關(guān)儀器參數(shù)并操作，試劑盒均購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，HCV試劑盒的檢測下限為1.0×103IU/mL，HBV試劑盒的檢測下限為5.0×102IU/mL。

1.3 RNA提取 采用TRIzol法。所有研究對象采集5 mL EDTA抗凝血用于分離PBMC，同時(shí)采集5 mL無添加劑外周血分離血清。每毫升TRIzol加入氯仿200 μL，劇烈振蕩15 s，室溫靜置10 min，離心(12 000 g,15 min,4 ℃);吸取上層水相加等體積異丙醇，顛倒混勻，冰上靜置10 min，離心(12 000 g,10 min,4 ℃)；棄上清，加1 mL預(yù)冷的75%乙醇(DEPC水現(xiàn)配)洗滌，離心(8 000 g, 5 min,4 ℃);棄上清，加入DEPC 20 μL水溶解RNA，測RNA濃度并計(jì)算所需RNA體積，每個(gè)樣品取4 μg的RNA做逆轉(zhuǎn)錄，因此每管中需加入的RNA體積為VRNA(μL)=4/CRNA。

1.4 血清和PBMC中miR-122、miR-29b表達(dá)檢測 miRNA的逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR: 采用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，本次試驗(yàn)以cel-miRNA-39為內(nèi)參, 擴(kuò)增反應(yīng)體系參照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體系為20 μL。EP管中加入VRNA+V水+1 μL Oligdt (共12 μL)，PCR儀70 ℃，反應(yīng)5 min；取出置于冰上，加入預(yù)混液(1 μL RNasin、1 μL rRNasin、4 μL 5×buffer和2 μL dNTP mix)共8 μL，PCR儀42 ℃反應(yīng)60 min，合成的cDNA用于qRT-PCR。取4 μL逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以miR-122、miR-29b熒光定量PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，熒光定量PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，42個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。以2-△△Ct法進(jìn)行結(jié)果比較分析，△△Ct =(Ct目的基因- Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。

2 結(jié)果

2.1 各組血清和PBMC中miR-122表達(dá)比較 對照組、HCV組、HBV組、HCV+HBV組血清中miR-122表達(dá)分別為(8.2±1.4) ×10-3、(20±4) ×10-3、(9±3) ×10-3、(23±5) ×10-3；PBMC中miR-122表達(dá)分別為(1.43±0.29)×10-5、(4.53±0.83)×10-5、(1.67±0.46)×10-5、(4.49±1.14)×10-5。與對照組相比，HCV組、HCV+HBV組血清和PBMC中miR-122表達(dá)均升高，其中HCV組血清和PBMC中miR-122表達(dá)高于對照組(P均<0.05)，HCV+HBV組血清和PBMC中miR-122表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2 各組血清和PBMC中miR-29b表達(dá)比較 對照組、HCV組、HBV組、HCV+HBV組血清中miR-29b表達(dá)分別為(3.35±0.48)×10-5、(2.44±0.517)×10-5、(2.05±0.27)×10-5、(6.87±1.74)×10-5；PBMC中miR-29b表達(dá)分別為(4.46±1.17)×10-4、(5.1±3.66)×10-4、(2.59±0.22)×10-4、(0.52±0.5)×10-4。與對照組相比，HCV組、HBV組、HCV+HBV組雖能檢測到血清和PBMC中miR-29b表達(dá)水平有所下降，但與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

3 討論

HCV屬于黃病毒科單股正鏈RNA病毒，HCV感染可引發(fā)丙型肝炎，因臨床癥狀隱匿，往往多年不被發(fā)現(xiàn)，隨著HCV在體內(nèi)復(fù)制可持續(xù)損傷細(xì)胞，逐步發(fā)展為慢性肝炎、肝硬化、肝癌等嚴(yán)重肝病。因此，早期診斷HCV感染性疾病對防控HCV感染及相關(guān)疾病的治療和預(yù)后尤為重要。

自2005年Jopling等[8,9]首次報(bào)道m(xù)iR-122可輔助HCV復(fù)制，miR-122就成為肝臟-HCV相互作用研究的焦點(diǎn)[10,11]。miR-122是肝臟特異性表達(dá)的微小RNA，參與肝臟的功能代謝，其可通過與HCV病毒的5′UTR兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的相互作用促進(jìn)病毒復(fù)制[12,13]；miR-122還可通過在翻譯起始階段增強(qiáng)核糖體與病毒RNA的親和力促進(jìn)HCV復(fù)制。此外miR-122還可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞核因子6、AMP依賴蛋白激酶、過氧化物酶體增殖物活化受體等多種因子，影響肝臟的發(fā)育、分化和體內(nèi)平衡及代謝功能[14]。有研究[15]表明，miR-122是HCV復(fù)制必須的宿主因子，HCV的穩(wěn)定和增殖與肝臟表達(dá)的miR-122同HCV基因組功能性相互作用密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，HCV感染后患者血清及PBMC中miR-122的表達(dá)均升高，其中HCV組中miR-122高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,此與Varnoholt等[16]結(jié)果一致。同時(shí)我們觀察到HCV和HBV雙重感染的患者血清及PBMC中miR-122表達(dá)高于HBV單一感染患者，提示HBV單一感染和HCV合并感染患者中miR-122的復(fù)雜相互作用需進(jìn)一步研究和探索。

miR-122是第一個(gè)被證明與HCV復(fù)制相關(guān)的miRNA，且在肝臟中特異表達(dá)，miR-122占肝細(xì)胞表達(dá)miRNA的72%，參與調(diào)控肝細(xì)胞中多種代謝通路。抑制miR-122表達(dá)可能影響肝細(xì)胞代謝，因此其他在HCV與宿主相互作用中起作用的miRNA，亦可能成為抗HCV研究的靶標(biāo)。目前研究報(bào)道了多種可影響HCV感染的miRNA[17]，或由于HCV感染而發(fā)生改變的miRNA，如miR-29b、miR-196b等可抑制HCV復(fù)制[18～21]，這些miRNA可作為抗HCV治療的新靶標(biāo)，本研究中，單一感染HCV患者的血清及PBMC中miR-29b表達(dá)略降低，但與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能是miR-29b在肝細(xì)胞中表達(dá)量較低，提示miR-29b在HCV相關(guān)性肝病中的作用有待進(jìn)一步研究。

此外，我們的研究存在一些局限性。首先，收集大宗病例較困難，這可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)結(jié)果不足以完全解決上述問題。其次，沒有進(jìn)行血液標(biāo)本采集，且并非所有的患者都有可用于病毒學(xué)檢測的血液樣本。因此，本研究無法控制某些因素可能影響miR-122表達(dá)或治療結(jié)果。

綜上所述，在感染HCV的患者中，血清和PBMC中miR-122表達(dá)升高，并且在單一感染HCV的患者中最高，miR-122有望成為HCV相關(guān)性肝病新的抗病毒藥物靶點(diǎn)或新的診斷生物標(biāo)志物。