大學生理學實驗教學中新的骨骼肌收縮實驗的創立

王慧平, 姚國虎, 馬吉英, 周小慧, 孫溢澤, 常 惠

(1. 西北大學 生命科學學院， 西安 710069； 2. 北京師范大學 燕化附中， 北京 102500)

生理學是一門實驗性科學，實驗教學是生理學教學的重要組成部分。在我國很多高等院校的生理學教學實驗(高等醫學院校的機能學教學實驗)中，均開設有骨骼肌收縮實驗。骨骼肌收縮實驗以骨骼肌的收縮功能為觀測對象，包括刺激強度與骨骼肌收縮反應的關系、骨骼肌單收縮曲線的描記與分析、骨骼肌收縮的總和與強直收縮、骨骼肌電興奮與收縮的時相關系等系列實驗。這一實驗直觀地體現了骨骼肌收縮的張力變化及收縮特點，是較為經典的生理學實驗。

在現行的生理學或機能學實驗指導教材及各院校的實際教學中，這一系列實驗均是以兩棲類動物的離體坐骨神經——腓腸肌(縫匠肌)標本為實驗材料進行的[1-5]。但在多年的教學實踐中，我們發現使用兩棲類動物離體神經——骨骼肌標本存在著以下幾點缺陷：1)標本制備步驟相對復雜，包括動物雙毀髓、分離神經、縱向剪開脊柱等，在此過程中易對神經活性產生影響；2)兩棲類動物的骨骼肌不能完全反映哺乳動物骨骼肌的收縮特性，如哺乳動物骨骼肌有快縮型和慢縮型，二者收縮速率不同，兩棲類動物骨骼肌無快慢之分；3)使用兩棲類動物較難展示某些病理或環境因素對骨骼肌收縮功能的影響，較難探討骨骼肌細胞內與收縮功能相關的生理生化指標的變化，使得實驗無法拓展與深化；4)每只動物僅使用后肢，其余組織棄之不用，造成實驗動物資源浪費；5)由于監管不力、經費不足或受限于當地的實際情況，部分院校使用的是野生兩棲動物，長此以往，對當地的野生動物資源及環境造成損害。

本教研室承擔著我校生理學的教學工作，近年來致力于骨骼肌廢用性萎縮研究，其中骨骼肌收縮功能是重要研究指標之一，截至目前我們已發表多篇中英文論文[6-10]，在哺乳動物骨骼肌收縮功能的研究上有著豐富的經驗和成熟的技術。針對上述骨骼肌收縮實驗的不足，結合我們的科研優勢，我們創立了新的骨骼肌收縮實驗，以期達到以研帶教、以教促研的目的，實現科研和教學的緊密結合。這一新的骨骼肌收縮實驗已在我校本科生理學實驗教學中開設，收到了良好的教學效果。現將這一新的骨骼肌收縮實驗予以簡單介紹，以供廣大教學工作者參考。

1 實驗名稱、目的及原理

我們將這一新的骨骼肌收縮實驗命名為“模擬太空失重對骨骼肌收縮功能的影響”。主要目的是通過此實驗，使學生學習肌肉實驗的電刺激方法及肌肉收縮的記錄方法，觀察不同刺激強度及刺激頻率引起的骨骼肌收縮功能的改變，對比骨骼肌快縮肌與慢縮肌收縮時程及供能方式的異同，初步了解太空失重環境對骨骼肌生理功能的影響。實驗原理包括了刺激強度與骨骼肌收縮反應的關系，骨骼肌收縮的總和，不同刺激頻率引起的骨骼肌收縮形式的改變[4]，哺乳動物慢縮型與快縮型骨骼肌的收縮特性及供能方式[11]，及航天失重造成骨骼肌發生廢用性萎縮時骨骼肌形態、收縮功能、能量代謝形式上的改變[12]等相關生理學知識。

2 實驗步驟

2.1 模擬失重大鼠模型制備

實驗前，成年雌性SD大鼠尾部懸吊14 d以造成其后肢比目魚肌(Soleus, SOL)發生廢用性萎縮，此為模擬失重組(Simulated weightlessness group, SWL)，懸吊方法參考文獻[7]。正常對照組(Normal control group, CON)不做任何處理。兩組大鼠均常規飼養。

2.2 大鼠手術處理

CON與SWL組大鼠稱重，常規腹腔注射麻醉后側位固定于恒溫手術臺上，一側后肢脛部外側剪毛，剪開皮膚，暴露脛部肌肉，于脛骨與腓腸肌間找到SOL。將SOL與周圍組織分離，SOL下端肌腱處穿線結扎，并于扎線下方剪斷肌腱，使其下端游離，SOL上端仍與脛部相連，SOL處于半游離狀態。

2.3 系統連接

將SOL下端肌腱扎線與張力換能器水平連接。調整張力換能器的方位使SOL、扎線、張力換能器處于同一水平面上，SOL與扎線在同一直線上且與張力換能器成90°，SOL的初始長度與其在體內舒張時的自然長度一致，并注意減少脛部創口處其他肌肉組織與SOL的觸碰。將雙針式刺激電極輕置于SOL的上半部分，通過電子刺激器輸出電刺激引發SOL收縮，張力信號由Powerlab生理信號采集系統(ADInstruments公司)采集并記錄。

2.4 SOL收縮張力記錄

2.4.1 單收縮

設置電子刺激器各項參數，手控發出電刺激，每次刺激間隔30 s以避免SOL因連續刺激疲勞而影響實驗結果。刺激強度從0 V開始緩慢增大，同時觀察SOL的收縮情況及張力曲線的變化情況。當刺激引發SOL做肉眼可見的微小收縮，張力曲線有微小波動時，此時的刺激強度視為該SOL的閾強度。繼續緩慢增大刺激強度，SOL收縮強度逐漸增大，直至SOL出現最大收縮，張力曲線變化幅度不再升高為止，此為最大單收縮曲線。做出6個最大單收縮曲線，在每個曲線上測量：Pt(單收縮最大張力)、TPT(達到最大張力所需時間)、RT75(從舒張開始至舒張了75%最大張力所需時間)，以均數作為該SOL單收縮的功能指標。

2.4.2 強直收縮

將刺激強度固定于一個閾上強度，調節刺激頻率，使用連續刺激觀察收縮的融合。逐漸增加刺激頻率直至SOL出現不完全強直收縮，繼續增加刺激頻率直至出現完全強直收縮。每3 min重復一次完全強直收縮，共6次。在完全強直收縮張力曲線上測量Po(完全強直收縮最大張力)，以均數作為該SOL強直收縮的功能指標。

2.5 檸檬酸合酶(Citrate synthase, CS)活性測定

取出另一側后肢的SOL，生理鹽水清洗后濾紙吸干表面水漬，稱重，如不立即測定可液氮冷凍保存。檸檬酸合酶(CS)是有氧代謝三羧酸循環的限速酶，測定CS活性可初步反映有氧代謝能力的高低。使用酶標法CS活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定SOL內CS的活性。

2.6 數據分析

將模擬失重大鼠與正常對照大鼠的各數據結果進行對比，數據的變化反映了模擬失重對大鼠骨骼肌收縮功能的影響。若兩組大鼠的數量滿足統計需求，可使用兩獨立樣本t檢驗進行顯著性檢驗，使結果更具說服力。

3 新實驗的教學效果及分析

本實驗自2015年創立以來，已在我校動物生理學實驗教學中連續開設了3年，累計已有約450名本科學生使用了136只大鼠進行本實驗。因為本實驗在操作步驟方面較為簡單，故而成功率高，2017年我們使用了42只大鼠，其中34只實驗成功，成功率為81%，較高的實驗成功率保證了教學的順利進行。兩組大鼠比目魚肌的單收縮與完全強直收縮曲線如圖1所示，數據統計結果見表1。

同正常對照組相比，模擬失重組大鼠SOL肌重下降21.23% (P<0.01)，Pt與Po分別減小37.05% (P<0.05)和45.86% (P<0.01)，TPT、RT75分別縮短24.19% (P<0.01)和19.25 (P<0.05)，CS活性降低24.72% (P<0.05)。此結果充分表明了模擬失重使得大鼠SOL肌質量丟失、收縮力下降，收縮類型由慢肌向快肌轉化、有氧代謝能力下降，體現了中長期失重狀態下哺乳動物骨骼肌發生的廢用性萎縮，實驗取得了良好的數據結果及教學效果。

圖1 比目魚肌張力曲線

表1 模擬失重后骨骼肌收縮功能的變化

*P<0.05； **P<0.01； compared with CON group

4 小結

在我們之前已有學者對傳統的骨骼肌收縮實驗進行了改進，提出使用牛蛙、小鼠替代蛙和蟾蜍，使用在體坐骨神經——腓腸肌標本替代離體標本[13-14]。這些改進簡化了傳統實驗的實驗步驟，降低了操作難度，提高了實驗成功率。我們創立的此新實驗，動物手術過程亦得以簡化，亦用在體標本替代了離體標本使得標本活性得以較好維持。另外還可減少實驗動物消耗，后肢手術創口縫合待動物蘇醒后，還可用于其他實驗，節約實驗經費，提高教學投入效益。更為重要的是，此新實驗不僅能夠涵蓋傳統實驗的實驗目的，還能展示中長期失重對哺乳動物骨骼肌生理功能的影響，通過化科研于教學，使得傳統實驗得以拓展。另外，此實驗為學生了解航天生理提供了一個窗口，在我國載人航天事業蓬勃發展的今天，更能激發學生們學習生理學、研究生理學的興趣。

本實驗在將科研成果轉化為教學內容方面做了初步嘗試。對于大多數高校教師而言，往往都承擔著科研與教學的雙重任務，將自身科研成果轉化為本科教學資源，不但可使高校教師的科研優勢得以發揮，更可有效提升教學水平，從而提高學生理論聯系實際、解決實際問題的能力，促進創新創業型人才的培養[15-19]。